医学微生物学实验：实验二

1、医学微生物学实验实验二实验内容实验内容1.1.细菌接种法（示教），细菌接种法（示教），平板分区划线接种（操作，每平板分区划线接种（操作，每人一份）人一份）2.2.溶菌酶试验（操作，每组一份）溶菌酶试验（操作，每组一份）3.3.吞噬作用（结果示教）吞噬作用（结果示教）4.4.外毒素及抗毒素作用（结果示教外毒素及抗毒素作用（结果示教）一、细菌接种法一、细菌接种法培养基：培养基：人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。分类：分类：据培养基的物理状态分类据培养基的物理状态分类：液体培养基，固体培养基，半固体培养基;据对培养基成分了解程度分类：据对培养基成分了解程度分类：合成培养基，

2、天然培养基；据营养组成和用途分类据营养组成和用途分类：基础培养基，增菌培养基，选择培养基，鉴别培养基，厌氧培养基。细菌接种法细菌接种法原理：原理： 用接种环（针）沾取细菌或标本，通过划线涂抹等方法，将细菌接种到合适的培养基上，并在一定的条件下使细菌得以生长繁殖。 接种环（针）灭菌俟冷沾取细菌或标本进行接种环灭菌步骤和方法1. 接种工具接种工具2.2.接种环境接种环境 接种罩 超净工作台 无菌室3.接种方法接种方法根据待检标本性质、培养目的和所用培养基的性质采用不同的接种方法。1） 平板划线分离培养法：平板划线分离培养法：使标本混杂混杂的多种细菌分散成单个细菌单个细菌。 *连续划线分离法 *分区

3、划线分离法平板分区划线分离法平板分区划线分离法菌落菌落平板分区划线分离混杂菌金黄色葡萄球菌菌落 （S型菌落）结核分枝杆菌菌落（R型菌落）肺炎链球菌（M型菌落）细菌的菌落细菌的菌落2）斜面接种法：）斜面接种法： 主要用于纯种移植，以进一步鉴鉴定或保存定或保存菌种菌苔菌苔3）液体接种法：）液体接种法：可观察到细菌不同的生长现象4）半固体穿刺接种法：）半固体穿刺接种法：可用于保菌或观察动力5）涂布接种法：）涂布接种法：用于标本中菌数测定和药敏试验的细菌接种细菌接种法细菌接种法n结果示教结果示教：半固体（小）：大肠埃希菌、白色葡萄球菌； 肉汤管（小）：大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、乙型链球菌； 斜面（大）

4、：白色葡萄球菌； 普平分区划线结果：金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌混合菌液n操作示教操作示教：普通平板：平板分区划线分离法； 半固体：半固体穿刺接种法； 肉汤管：液体接种法； 斜面：斜面接种法n操作操作： 平板分区划线接种法（操作，每人一份）二、溶菌酶试验二、溶菌酶试验原理：n溶菌酶能裂解G+菌的胞壁肽聚糖中N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的-1，4糖苷键，破坏聚糖骨架，引起细菌裂解。nG-菌因为细胞壁外有外膜一般不受溶菌酶的影响。n溶菌酶是非特异性免疫中一种重要体液杀菌成分。n方法：1、菌液的准备2、溶壁微球菌琼脂平板的制备3、用清水漱口，片刻后将唾液吐于小烧杯中，用毛细吸管吸出滴入孔内（不要

5、溢出），同时加PBS于一孔中作阴性对照，加鸡蛋清于一孔中作阳性对照。4、放置室温，18h后观察结果。n结果：测量并记录溶菌环直径。+-？二、溶菌酶试验二、溶菌酶试验注意注意 1.往孔内加样时，不能溢出孔外。 2.孔内不能有气泡。 3.做好标记，不要混淆。二、溶菌酶试验二、溶菌酶试验+-？三、吞噬作用三、吞噬作用吞噬细胞吞噬细胞 小吞噬细胞：小吞噬细胞：血液中的中性粒细胞血液中的中性粒细胞 大吞噬细胞：大吞噬细胞：固定于组织中的巨噬细胞和血固定于组织中的巨噬细胞和血 液中的单核细胞液中的单核细胞作用：非特异性吞噬、杀伤和消化侵入的病原体，作用：非特异性吞噬、杀伤和消化侵入的病原体， 是机体天然防

6、御的重要机制之一是机体天然防御的重要机制之一1、中性粒细胞的吞噬作用n方法：（1）取金葡球菌1-2ml，注射于小白鼠腹腔。（2）5h后将动物解剖，用无菌棉拭子取腹腔液作涂片，干燥后，用瑞氏法染色，观察小吞噬现象。n结果：记录并绘图小吞噬现象。小吞噬小吞噬 （中性粒细胞吞噬葡萄球菌）2、巨噬细胞的吞噬作用n方法：（1）取灭菌的1%可溶性淀粉溶液5ml注射于豚鼠腹腔内。（2）12h后注射5ml肉汤于豚鼠腹腔内。（3）1h后注射5ml鸡红细胞悬液于豚鼠腹腔内。（4）分别于1、6、24h抽取腹腔液少许涂片，干燥后，用瑞氏法染色，观察大吞噬现象。n结果：记录并绘图大吞噬现象。大吞噬大吞噬 （巨噬细胞吞噬

7、鸡红细胞）四、外毒素及抗毒素作用四、外毒素及抗毒素作用 外毒素是某些致病菌在生长繁殖过程中产生外毒素是某些致病菌在生长繁殖过程中产生并释放至体外的一种毒性蛋白质。主要由并释放至体外的一种毒性蛋白质。主要由某些革某些革兰阳性菌及少数革兰阴性菌产生兰阳性菌及少数革兰阴性菌产生。 外毒素不稳定，对热和某些化学物质敏感；外毒素不稳定，对热和某些化学物质敏感；其抗原性强，毒性作用也强，具有亲组织性，能其抗原性强，毒性作用也强，具有亲组织性，能选择性作用于某些器官，引起特殊病变；选择性作用于某些器官，引起特殊病变； 细菌外毒素对机体的毒性作用，可被细菌外毒素对机体的毒性作用，可被相应抗相应抗毒素毒素中和。中和。n方法：1、将破伤风梭菌接种于0.1%葡萄糖疱肉培养基中，37下培养48h，取上清离心，3000rpm ，30min，此上清中即含破伤风外毒素。2、于一只小白鼠后腿肌肉注射破伤风外毒素0.2ml。3、取另一只小白鼠，先在其腹腔中注射破伤风抗毒素0.2ml ，再于其后腿肌肉注射破伤风外毒素0.2ml。4、对两只小鼠作好标记，逐日观察有无发