DNA粗提取与鉴定实验

1、DNADNA粗提取与鉴定实验粗提取与鉴定实验 内容内容课题分析课题分析1实验操作原理实验操作原理5材料器具材料器具3实验理论基础实验理论基础4教学建议教学建议2实验步骤实验步骤6一、课题分析一、课题分析n1 1. .教学教学目标目标 （1 1）分析）分析DNADNA的性质及提取的基本思路。的性质及提取的基本思路。 （2 2）探究不同手段提取）探究不同手段提取DNADNA的实验过程。的实验过程。 （3 3）掌握）掌握DNADNA提取的过程并灵活运用。提取的过程并灵活运用。n2 2. .背景描述背景描述生物体的性状之所以能够遗传给后代，是由于其体内具有生物体的性状之所以能够遗传给后代，是由于其体内

2、具有DNADNA或或RNARNA这些遗传物质，这些遗传物质，DNADNA是遗传物质已经通过实验证实是遗传物质已经通过实验证实。那么那么DNADNA究竟什么样究竟什么样？本本课题通过尝试对植物或动物组织中的课题通过尝试对植物或动物组织中的DNADNA进行粗提取，了解进行粗提取，了解DNADNA的的理化性质，理解理化性质，理解DNADNA提取以及鉴定的原理，在一定层面感性认知提取以及鉴定的原理，在一定层面感性认知DNADNA。一、课题分析一、课题分析脱氧核苷酸脱氧核苷酸腺嘌呤腺嘌呤一、课题分析一、课题分析dAMPdAMPdTMPdTMPdCMPdCMPdGMPdGMP胸腺嘧啶胸腺嘧啶腺嘌呤腺嘌呤鸟

3、鸟嘌呤嘌呤核苷酸结构核苷酸结构一、课题分析一、课题分析n 脱氧核糖（五碳糖）与磷酸分子借由酯键相连，组成其长链骨架，脱氧核糖（五碳糖）与磷酸分子借由酯键相连，组成其长链骨架，排列在外侧，四种碱基排列在内侧。每个糖分子都与四种碱基里的排列在外侧，四种碱基排列在内侧。每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连，这些碱基沿着其中一种相连，这些碱基沿着DNADNA长链所排列而成的序列，可组成长链所排列而成的序列，可组成遗传密码遗传密码，指导蛋白质的合成。，指导蛋白质的合成。一、课题分析一、课题分析n 读取读取密码的过程称为密码的过程称为转录转录。n 是是以以DNADNA双链中的一条单链为模双链中的一条单链

4、为模板转录出一段称为板转录出一段称为mRNAmRNA（信使信使RNARNA）的核酸分子）的核酸分子。n 多数多数RNARNA带有合成蛋白质的讯息，带有合成蛋白质的讯息，另有一些本身就拥有特殊功能，另有一些本身就拥有特殊功能，例如例如rRNArRNA、snRNAsnRNA与与siRNAsiRNA。一、课题分析一、课题分析n 在在细胞内，细胞内，DNADNA能与蛋白质结能与蛋白质结合形成合形成染色体染色体，整组染色体则，整组染色体则统称为统称为染色体组染色体组。n 人正常人正常的人体细胞中含有的人体细胞中含有4646条条染色体染色体。n 染色体在染色体在细胞分裂细胞分裂之前会先在之前会先在分裂间期

5、分裂间期完成复制，细胞分裂完成复制，细胞分裂间期又可划分为：间期又可划分为：G1G1期期-DNA-DNA合合成前期、成前期、S S期期-DNA-DNA合成期、合成期、G2-G2-DNADNA合成后期。合成后期。一、课题分析一、课题分析n DNADNA是高分子聚合物，是高分子聚合物，DNADNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘度，溶液为高分子溶液，具有很高的粘度，可被可被甲基绿甲基绿染成绿色染成绿色。n DNADNA对紫外线（对紫外线（260nm260nm）有吸收作用，利用这一特性，可以对）有吸收作用，利用这一特性，可以对DNADNA进行含量测定进行含量测定。n 当当核酸变性时，吸光度升高，称为核

6、酸变性时，吸光度升高，称为增色效应增色效应；当变性核酸重新；当变性核酸重新复性时，吸光度又会恢复到原来的水平复性时，吸光度又会恢复到原来的水平。n 较高较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起DNADNA分子变性，即分子变性，即DNADNA双链碱基间的氢键断裂，双螺旋结构解开双链碱基间的氢键断裂，双螺旋结构解开也也称为称为DNADNA的解螺旋。的解螺旋。洋葱内表皮细胞洋葱内表皮细胞DNA被甲基绿染成绿色，被甲基绿染成绿色，RNA被派洛宁染成红色被派洛宁染成红色二、教学建议二、教学建议n 科学科学的探究一般过程为的探究一般过程为“发现问

7、题发现问题提出假设提出假设设计实验设计实验预预测结果测结果得出结论得出结论”。n 通过通过本实验的设计的具体的实施，是学员能够接受科学的训练，本实验的设计的具体的实施，是学员能够接受科学的训练，在训练过程中举一反三，从理论到实践认知在训练过程中举一反三，从理论到实践认知DNADNA的提取过程和操的提取过程和操作原理作原理。n 从从DNADNA的物质组成，到的物质组成，到DNADNA的复制时期，联系生物学现象。在理的复制时期，联系生物学现象。在理解解DNADNA的理化性质的基础上，利用其理化性质对的理化性质的基础上，利用其理化性质对DNADNA进行分离。进行分离。三、材料器具三、材料器具n 材料

8、材料：新鲜：新鲜菠菜菠菜4kg4kg。n 试剂试剂：氯化钠：氯化钠1000g1000g、SDS 500gSDS 500g、无水乙醇、无水乙醇4000ml4000ml、二二苯胺苯胺200ml200ml。n 器材器材：200ml200ml烧杯烧杯6060个、试管个、试管100100支、研钵支、研钵3030个、玻璃个、玻璃棒棒3030个、纱布个、纱布2 2包、不锈钢药勺包、不锈钢药勺3030个、滤纸个、滤纸5 5包。包。n 仪器仪器：天平：天平2 2台、水浴锅台、水浴锅2 2个、漏斗个、漏斗3030个。个。n DNADNA是大分子高分子聚合物，是大分子高分子聚合物，DNADNA溶液为溶液为高分子溶液

9、高分子溶液，具有很高的粘度。具有很高的粘度。DNADNA对紫外线有吸收作用，当核酸对紫外线有吸收作用，当核酸变性时，吸光值升高；变性时，吸光值升高；n 当变性核酸可复性时，吸光值又会恢复到原来水平。当变性核酸可复性时，吸光值又会恢复到原来水平。温度、有机溶剂、酸碱度、尿素、酰胺等试剂都可以温度、有机溶剂、酸碱度、尿素、酰胺等试剂都可以引起引起DNADNA分子分子变性变性，即使得，即使得DNADNA双键间的氢键断裂，双双键间的氢键断裂，双螺旋结构解开。螺旋结构解开。四、实验理论基础四、实验理论基础n 1 1、DNADNA对酶、高温和洗涤剂的耐受对酶、高温和洗涤剂的耐受性性蛋白酶蛋白酶能水解蛋白质

10、，但是对能水解蛋白质，但是对DNADNA没有影响没有影响；大多数大多数蛋白质不能忍受蛋白质不能忍受60608080的高温，而的高温，而DNADNA在在8080以上才会以上才会变性变性；洗涤剂洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质, ,但对但对DNADNA没没有影响。有影响。四、实验理论基础四、实验理论基础n 2 2、DNADNA的溶解度的溶解度DNADNA和蛋白质等其他成分在不同和蛋白质等其他成分在不同浓度的浓度的NaClNaCl溶液溶液中溶解度不同，中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使浓度就能使DNADNA充

11、分溶解，而使充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反。杂质沉淀，或者相反。四、实验理论基础四、实验理论基础n 3 3、DNADNA在酒精溶液中的溶解性在酒精溶液中的溶解性DNADNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将利用这一原理，可以将DNADNA与蛋白质进一步分离。与蛋白质进一步分离。n 1 1、实验材料的选取、实验材料的选取凡是凡是含有含有DNADNA的生物材料都可以考虑，但选用的生物材料都可以考虑，但选用DNADNA含量相对较高含量相对较高的生物组织，更具有操作性，根据实验目的选取适当的材料和的生物组织，更

12、具有操作性，根据实验目的选取适当的材料和方法方法。鱼卵鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。五、实验操作原理五、实验操作原理n 2 2、细胞破碎、细胞破碎动物细胞动物细胞：没有：没有细胞壁破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸细胞壁破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水馏水 ，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。原理：蒸馏水对于细胞来说是一种原理：蒸馏水对于细胞来说是一种低渗低

13、渗液体，水分可以大量进入血细胞内，液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了细胞的破裂使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了细胞的破裂( (细胞膜和细胞膜和核膜的破裂核膜的破裂) )，从而释放出，从而释放出DNADNA。植物细胞植物细胞：需要先用一定的洗涤剂和氯化钠溶解细胞膜，洗涤剂是一些离：需要先用一定的洗涤剂和氯化钠溶解细胞膜，洗涤剂是一些离子去污剂，能子去污剂，能溶解细胞膜溶解细胞膜，有利于，有利于DNADNA的释放，氯化钠有利于的释放，氯化钠有利于DNADNA的溶解。的溶解。研磨：使研磨：使DNADNA充分释放，洗涤剂等更容易充分接触细胞膜。用充

14、分释放，洗涤剂等更容易充分接触细胞膜。用液氮研磨液氮研磨可可有效的防止有效的防止DNADNA降解。降解。五、实验操作原理五、实验操作原理n 2 2、细胞破碎、细胞破碎n DNADNA降解的原因：降解的原因： 温度温度：高温：高温, ,易加速磷酸二酯键的水解易加速磷酸二酯键的水解。湿度湿度：参与磷酸二酯键的水解：参与磷酸二酯键的水解 、影响、影响DNADNA螺旋的形成结构螺旋的形成结构。pHpH值：氢离子参与与催化磷酸二酯键的水解值：氢离子参与与催化磷酸二酯键的水解 、过高或过低的、过高或过低的pHpH值都易破坏氢键值都易破坏氢键 。氧氧化反应：氧化碱基中的含氮杂环化反应：氧化碱基中的含氮杂环,

15、 ,使其变性使其变性, ,从而进一步改变从而进一步改变一级与二级的一级与二级的DNADNA构象构象。DNADNA降解降解酶：水解酶：水解DNADNA。五、实验操作原理五、实验操作原理n 3 3、DNADNA的纯化的纯化细胞破碎细胞破碎后主要含有蛋白、多糖和后主要含有蛋白、多糖和RNARNA等杂质。可根据等杂质。可根据DNADNA的的性性质进行质进行纯化。首先可通过纯化。首先可通过过滤过滤、离心离心等方法去除不溶解的等方法去除不溶解的杂质，杂质，然后然后再进一步纯化再进一步纯化。氯化钠氯化钠中的溶解度，氯化钠浓度为中的溶解度，氯化钠浓度为2mol/l2mol/l时时DNADNA溶解度最大溶解度最

16、大，可，可在此浓度下先溶解在此浓度下先溶解DNADNA，然后过滤去除不溶解的杂质，然后在，然后过滤去除不溶解的杂质，然后在DNADNA溶解度最低的氯化钠溶液中（溶解度最低的氯化钠溶液中（0.14mol/l0.14mol/l）使）使DNADNA析出，再过析出，再过滤去除溶解在氯化钠溶液中的杂质。滤去除溶解在氯化钠溶液中的杂质。五、实验操作原理五、实验操作原理n 3 3、DNADNA的纯化的纯化利用利用蛋白酶蛋白酶降解蛋白质，加入嫩肉粉（木瓜蛋白酶）、蛋白酶降解蛋白质，加入嫩肉粉（木瓜蛋白酶）、蛋白酶K K等，降解蛋白质等，降解蛋白质。适当适当温度温度降解蛋白质，降解蛋白质，65-7065-70，

17、DNADNA不会被变性，蛋白会变性。不会被变性，蛋白会变性。不溶于水的不溶于水的有机溶剂有机溶剂，酚、氯仿等，酚、氯仿等，DNADNA不溶于这类试剂，蛋白不溶于这类试剂，蛋白质可溶解在其中，通过静止或离心使有机试剂和水分离，去除质可溶解在其中，通过静止或离心使有机试剂和水分离，去除杂质。杂质。DNADNA结合柱结合柱，硝酸纤维素膜等，在酸性条件下可结合，硝酸纤维素膜等，在酸性条件下可结合DNADNA，中性，中性和碱性条件下结合能力差。通过和碱性条件下结合能力差。通过DNADNA的等电点调节其所带电荷为的等电点调节其所带电荷为正电或负电，通过孔径去除大分子和小分子。正电或负电，通过孔径去除大分子

18、和小分子。五、实验操作原理五、实验操作原理n 4 4、DNADNA的析出的析出溶溶于水的有机溶剂可使于水的有机溶剂可使DNADNA析出，水更容易和有机试剂结合，使析出，水更容易和有机试剂结合，使DNADNA析出，如一定浓度析出，如一定浓度乙醇、异丙醇乙醇、异丙醇（乙醇浓度一般在（乙醇浓度一般在48-67.5%48-67.5%，异丙醇浓度在异丙醇浓度在36%36%以上，浓度越高效果越好），低温效果更好以上，浓度越高效果越好），低温效果更好（杂质较多），同时，可在一定程度上出去溶于该有机试剂的（杂质较多），同时，可在一定程度上出去溶于该有机试剂的杂质杂质。n 5 5、DNADNA的的溶解溶解一般采

19、用一般采用TETE（Tris-EDTATris-EDTA，pH8.0pH8.0）缓冲液或）缓冲液或去离子水。去离子水。五、实验操作原理五、实验操作原理n 6 6、 DNADNA的的鉴定鉴定DNADNA与与二苯胺（二苯胺（沸水浴）会染成沸水浴）会染成蓝色；蓝色；可可被被甲基绿甲基绿染成绿色染成绿色；DNADNA对紫外线（对紫外线（260nm260nm）有吸收作用）有吸收作用；DNADNA可与溴化乙锭（可与溴化乙锭（EBEB）花青素类染料结合，可在紫外光下激发）花青素类染料结合，可在紫外光下激发荧光荧光。五、实验操作原理五、实验操作原理1.1.植物材料的植物材料的研磨研磨：称称取新鲜植物材料（菠菜）取新鲜植物材料（菠菜）100g100g，表面清洗后，表面清洗后，在研钵中充分研磨，可加入石英砂，将植物组织充分研磨（可加入在研钵中充分研磨，可加入石英砂，将植物组织充分研磨（可加入适量的提取缓冲液）。适量的提取缓冲液）。2.2.将研磨好的样品取出置于将研磨好的样品取出置于200ml200ml烧杯中，加入烧杯中，加入100ml 10%100ml 10%的的SDSSDS轻轻轻混匀，轻混匀，6565水浴水浴10-15min10-15mi