间接免疫荧光法对多种呼吸道病毒快速检测方法

1、间接免疫荧光法对多种呼吸道病毒快速检测方法        【摘要】  目的：建立一种新的快速诊断呼吸道病原微生物感染检测方法。方法：采用德国欧蒙公司间接免疫荧光技术对578例患者进行流感病毒A（FluA）、流感病毒B（FluB）、副流感病毒1（PIV1)、副流感病毒2（PIV2)、副流感病毒3（PIV3)、腺病毒3(ADV3)以及合胞病毒(RSV)、肺炎支原体（MP）、肺炎衣原体（CP）、克雷白（KLB）、军团菌（LPS）、嗜血流感（HI）等12种病原微生物进行检测。结果：下呼吸道感染在儿童组阳性率为46

2、.1%（140/304),以合胞病毒感染最为多见；在成人组感染阳性率为42.0%（115/274），以腺病毒感染最为常见。结论：间接免疫荧光方法检测呼吸道病毒具有高灵敏度和特异性，而且操作简捷，适合临床实验室病毒检测的要求。 【关键词】  呼吸道病毒感染；间接免疫荧光；生物薄片技术；病原微生物急性上呼吸道疾病是由病原微生物感染引起的，其中病毒最为常见。因此呼吸道病毒感染的快速检测对临床及时诊断和疫情报告均有重要意义。但是传统的病毒分离鉴定操作复杂，难以应用到临床。近年来，作者应用间接免疫荧光抗体法对578例患者合胞病毒、腺病毒3、流感病毒等12项病原微生物进行了检测，现将结果报告如下

3、。    1  材料与方法    1.1  检测对象  检测对象均为本院2004年2月至2007年1月就诊呼吸道感染患者578例，在感染性疾病组中，成人274例，其中男162例，女112例，2456岁，平均年龄45岁；儿童304例，其中男187例，女117例，年龄211岁，平均年龄4岁。收集病史、胸部X线及部分辅助检查按照中华人民共和国传染病防治法规定的诊断标准均符合呼吸道感染(ARI)。住院后当日或次日取静脉血2mL,分离血清保存备用。    1.2  检测试剂&

4、#160; 病毒12项生物薄片（F1281-1002-8G德国欧蒙公司生物芯片，生产批号F060903UC），包括流感病毒A（FluA）、流感病毒B（FluB）,副流感病毒1（PIV1）、副流感病毒2（PIV2）、副流感病毒3（PIV3）、腺病毒3(ADV3)以及合胞病毒(RSV)、肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(CP)、克雷白(KLB)、军团菌(LPS)、嗜血流感(HI)等12种病毒。含伊文斯蓝荧光素标记的抗人荧光抗体（SIGMA公司，生产批号T070104）。    1.3  仪器  日本Olympus荧光显微镜。  &

5、#160; 1.4  检测方法  取患者血清20L，用PBS/Tween缓冲液进行110倍稀释，取25L加入到加样板中，用生物薄片进行压片，37孵育30分钟后，用PBS/Tween缓冲液冲洗3次，加入抗人标记的荧光标记抗体20L于加样板中，37孵育30分钟，然后用PBS/Tween缓冲液冲洗3次，干后用pH8.5甘油缓冲液封片，在荧光显微镜下观察结果，在相应区（A、B、C 3个区，每个区又分为4个小区，分别包被相应的12种病原微生物）内产生苹果绿色荧光，即为血清中有IgM抗体，为该病原微生物感染。    2  结果 

6、0;  呼吸道感染组各类型病毒检出率见表1。在儿童组,总检出率为46.1%,其中以合胞病毒感染最高为8.2%；在成人组总检出率为42.0%，其中以腺病毒3感染最高为8.2%。表1  成人与儿童呼吸道感染的病毒类型    3  讨论    病毒感染在呼吸道感染中约占70%80%1,但本组病例总检出率较报道低,平均为44.1%。随着各类抗生素的应用,细菌性感染有所下降,病毒性感染相对突出。呼吸道病毒感染的临床表现差异很大，轻者仅属隐性感染，重者可危及生命2。近年来又有研究证明细菌病毒间相互作用加强人肺肥大细胞

7、组胺释放，可在诱发呼吸道感染或加剧气道反应中发挥一定作用3。    目前诊断病毒的方法较多，传统的病毒分离检测法为电镜直接检测病毒颗粒，阳性率不高，而且电镜难以在临床实验室普及，应用时有一定限制，且诊断时间较长4。组织培养法过去常作为“金标准”，但近10年已被分子学方法所取代。近期内组织培养法对分析病毒种群(如每年的流感疫苗)的遗传学和抗原性变化以及发现新病毒仍具有重要作用5。分子检测是呼吸道病毒检测的新标准，与组织培养法或抗原检测法相比，它几乎具有100%的灵敏度和特异性，组织培养法和分子方法的比较研究表明，分子方法（如PCR技术）的灵敏度比组织培养方法高12%

8、30%6。近年来由于免疫技术的，特别是免疫标记技术的广泛应用，如直接免疫荧光法、抗碱性磷酸酶桥联酶标法等标记技术，检测方便，快速7-8。本文采用间接免疫荧光薄片新技术直接检测血清中病毒IgM抗体，能直接检查常见的下呼吸道感染12种病毒，对2种或2种以上的病毒也能同时检测，简便、快速、成本低廉适合于临床要求，因此在临床上有重要意义。1             在本研究中发现，578例ARI患者中，儿童组病原微生物IgM抗体检测阳性率为46.1%（140/304），其中以合胞病毒感染最多，

9、其次为流感病毒、腺病毒3型和支原体感染；成人组阳性率为42.0%（115/274），其中腺病毒感染最常见，共19例。常见病原微生物检出结果分别为：腺病毒3型、合胞病毒、流感病毒和克雷白，在两组检测中，单一病毒抗体阳性205例(255/578)，2种病毒抗体混合阳性87例(87/255)，3种及3种以上病毒抗体混合阳性32例(32/578)，与国外报道相似9-10。急性上呼吸道疾病95%是由细菌以外的感染源引起的，其中病毒最为常见，及早进行病毒检测对指导临床医生针对性、避免盲目使用抗生素及双重感染有重要作用，而且病毒流行有随季节、年龄变化的特点，对易感人群注射疫苗有重要的预防意义11。【】

10、60; 1 陶国华，郭新荣，吴俊渊.541例呼吸道病毒和病毒抗体检测分析J.标记免疫分析与临床，2004，7（1）：19-20.2 Zhao LQ,Qiany,Wang ZL,et al.Comparision of four methods used in detection of respiratory synectial virusJ.Linchuang Erke Zazhi,2003,21(1):20-242.2 朱毅 .呼吸道病毒感染与哮喘 J.临 床 肺 科 杂 志 ,2002,7(1):39-40.4 聂艳桃.病毒性呼吸道疾病的实验室诊断进展J.国外医学预防诊断治疗用生物制品分册

11、，2005，28（1）30-31.5 朱汝南,邓洁.2000年秋冬至 2002年夏北京地区急性呼吸道感染病毒病原学研究J.临床儿科杂志,2003,21(1):25-28.6 顾伟中，曹群，汤宏峰，等.直接免疫荧光法对呼吸道分泌物多种呼吸道病毒检测的临床意义J.实用儿科临床杂志，2004，19（10）：857-858.7 Welliver RC.Detection,pathogenesis,and therapy of repiratorysynytial virus infectionsJ.Clin Microbiol Rev,2005,39:275-278.8 Ray CG, Minnich LL.Efficiency of immunofluorescence for rapid detection of common respiratory virusesJ.Clin Microbiol,2002 ,(25):355-357.9 McDonald JC,Quennec P.Utility of a respiratory virus panel containing a monoclonal antibody pool for screening or repiratory specimeans in nonpeak respi