分子生物学课程

1、分子生物学课程教案 20072008学年第1学期授课专业：生物技术课程名称：分子生物学主讲教师： 何宁佳 查幸福 赵爱春 课程说明一、课程名称：分子生物学二、总课时数：45三、先修课程：基因工程原理四、使用教材：PC Turner, AG McLennan, AD Bates&MRH White, Instant notes in Molecular Biology,科学出版社，2004年1月第八次印刷五、教学参考书：1 PC特纳、AG麦克伦南、AD贝茨、MRH怀特，分子生物学-现代生物学精要速览中文版，科学出版社，2004年8月第七次印刷。2 朱玉贤， 李毅编著现代分子生物学，第二版

2、，高等教育出版社，2004年1月第3次印刷。六、考核方式：理论课采用闭卷考试的方法，总成绩，平时成绩30%，中期考试10%，期末考试60%七、教案编写说明：教案又称课时授课计划,是任课教师的教学实施方案。任课教师应遵循专业教学计划制订的培养目标，以教学大纲为依据，在熟悉教材、了解学生的基础上，结合教学实践经验，提前编写设计好每门课程每个章、节或主题的全部教学活动。教案可以按每堂课（指同一主题连续12节课）设计编写。教案编写说明如下：1、 编号：按施教的顺序标明序号。2、 教学课型表示所授课程的类型，请在相应课型栏内选择打“”。3、 题目：标明章、节或主题。4、 教学内容：是授课的核心。将授课的

3、内容按逻辑层次，有序设计编排，必要时标以“*”、“#”“？”符号分别表示重点、难点或疑点。5、 教学方式既教学方法，如讲授、讨论、示教、指导等。教学手段指教科书、板书、多媒体、模型、标本、挂图、音像等教学工具。6、 讨论、思考题和作业：提出若干问题以供讨论，或作为课后复习时思考，亦可要求学生作为作业来完成，以供考核之用。7、 参考书目：列出参考书籍、有关资料。8、 日期的填写系指本堂课授课的时间。课时教案讲 授 人查幸福课时1.5序号1课题内容Cells and macromolecules教学时间2007.09.03教学方法讲授教学课型理论 实验 习题实践 复习其它教学手段板书、多媒体教学目

4、的1.了解原核细胞和真核细胞结构、亚细胞及分子组成上的差异2.了解真核细胞亚细胞器的结构与功能3.掌握细胞和大分子的分类，及用以分析的一些方法重点难点细胞分类、亚细胞器教学内容备注A1 Cellular classification (细胞分类)Eubacteria(真细菌)和Archaea(古细菌)属原核细胞生物,它们一般由cell wall (细胞壁)、plasma membrane (细胞膜)、cytoplasm (细胞质)和nucleoid (类核体)构成，细胞中有质粒、核糖核酸、核糖体及各种蛋白质，没有亚细胞器。古细菌虽然在结构上与真细菌相似，但是其复制、转录和翻译更接近真核生物。E

5、ukaryotes(真核生物)包括动物、植物、真菌和原生生物（藻类和原生动物），其细胞体积较大，细胞质中含有细胞器、核糖体和由蛋白质纤维组成的细胞骨架，细胞核由膜包绕。植物、许多真菌和原生生物也有细胞壁。真核生物大多是多细胞，在发育过程中不同群细胞经分化形成特定组织。A2 Subcellular organells (亚细胞器)Nuclei (细胞核)携带细胞的遗传信息，每条染色体含有一个DNA分子。有核膜包围，内有核仁，核仁是rRNA合成和核糖体进行部分组装的场所。Mitochondria and chloroplasts (线粒体与叶绿体)线粒体是细胞产能的场所，由外膜和内膜组成，内膜突出

6、折叠成嵴，其内含有一个小的环状DNA分子、特异RNA和核糖体，可合成小部分线粒体蛋白，其所需要的大部分蛋白质则由细胞核DNA编码并在细胞质中合成。植物的叶绿体是光合作用的场所，依靠光同化CO2与水形成碳水化合物和氧气。叶绿体在内膜腔内有类囊体，类囊体上含有捕捉光能进行光合作用的叶绿素。叶绿体也能独立合成小部分蛋白质。Endoplasmic reticulum (内质网)是细胞质内与核膜相连的膜体系，光面内质网主要合成脂类及用于氧化解毒的酶。粗面内质网上有许多核糖体，特异合成分泌性蛋白质，经过初步的糖基化修饰，转运至高尔基体进一步修饰分检并分泌。Microbodies (微体)溶酶体有膜包绕，从

7、高尔基体出芽而成，含有丰富的消化酶，回收来自损伤细胞器或体外进入的大分子。过氧化物酶体含有破坏过氧化氢的酶，可防止过氧化氢和高活性自由基损伤细胞。乙醛酸循环体是特定的植物过氧化物酶体，进行乙醛酸循环。它们合称微体。Organelle isolation (细胞器的分离)大小和密度不同的细胞器，根据不同的沉降系数值采用差速离心法相互分离，并用密度梯度离心进一步纯化。A3 Macromolecules (生物大分子)Protein and nucleic acid (蛋白质和核酸)蛋白质是氨基酸以肽键连接而成的聚合体，它是体内重要的结构物质和功能物质。核酸（DNA和RNA）是核苷酸以3/，5/-磷

8、酸二酯键连接形成的聚合体，由含氮碱基、五碳糖和磷酸组成。核酸参与遗传信息的储存与加工，但这些信息的表达则需要蛋白质。Polysaccharides and lipids (多糖和脂类)也是重要的生物大分子。Complex macromolecules (复杂大分子)核蛋白是核酸与蛋白质的结合体，如端粒酶，核糖核酸酶P等。另外还有糖蛋白、蛋白多糖、脂蛋白和糖脂。A4 Large macromolecular assemblies (大分子的组装)Protein complexes (蛋白质复合体)细胞中多个构件和运动元件是由蛋白质复合体构成的。细胞骨架就是由微丝（肌动蛋白和肌球蛋白）、微管（微管

9、蛋白）和中间纤维等多种蛋白质构成。微丝组构细胞形态、控制细胞运动及亚细胞器在细胞内的分布。微管是细胞骨架、真核生物纤毛、鞭毛及表面毛状结构的主要组分。肌动蛋白和肌球蛋白也是肌肉纤维的主要组分。Nucleoprotein (核蛋白)由核酸与蛋白质组成。核糖体是较大的细胞质核糖核酸蛋白质复合体，是蛋白质的合成场所。细菌70S核糖体含有大亚基（50S）和小亚基（30S），50S亚基包含23S、5SRNA分子和31种蛋白质，30S亚基包含16SRNA分子和21种蛋白质。真核生物的80S核糖体含有60S（包括28S、5.8S和多种5SRNA）和40S（含18SRNA）两个亚基。染色质是构成真核生物染色体

10、的元件，由DNA与组蛋白组成的脱氧核蛋白复合体。病毒是核蛋白复合体的另一个例子。Membranes (膜)脂质双层分子与蛋白质构成细胞与细胞器的边界。外围膜蛋白结合在膜的外表或锚定在膜上。镶嵌膜蛋白被埋在膜中，跨膜蛋白横跨双层膜，突出膜的内外表面。膜蛋白有多种功能（参见教材P13）思 考 题与 作 业1.真核生物与原核生物的细胞结构的差异有哪些?2.细胞中各个亚细胞器分别行使什么功能?教学后记学生对这些知识点都容易接受，但对专业术语的英文不熟悉。在以后的教学中要经常提及，让学生熟悉这些专业英语。课时教案讲 授 人查幸福课时1.5序号2课题内容Protein structure教学时间教学方法讲

11、授教学课型理论 实验 习题实践 复习其它教学手段板书、多媒体教学目的1了解氨基酸的基本结构和分类2理解蛋白质一级结构和空间结构3了解蛋白质分析的常用方法和蛋白质组学重点难点氨基酸、蛋白质的结构与功能教学内容备注B1 Amino acids (氨基酸)L-氨基酸是蛋白质的基本构成单元，它们都有一个共同的结构，a-碳原子上连有一个羧基、一个氨基、一个质子和一个R侧链，氨基酸结构的差异主要表现为R侧链的区别。a-碳原子是手性碳原子，因此氨基酸具有D-和L-两种立体异构体。组成蛋白质的均为L-氨基酸。根据R-侧链的极性将氨基酸分类极性带电荷的氨基酸：酸性氨基酸-天冬氨酸、谷氨酸，碱性氨基酸-赖氨酸、精

12、氨酸和组氨酸。极性不带电的氨基酸 ；非极性氨基酸（参见教材）B2 Protein structure and function (蛋白质结构与功能)大小与形状蛋白质分为球蛋白和纤维蛋白两类。酶多为球形蛋白，纤维蛋白是重要的结构蛋白，如羊毛和头发中的角蛋白与丝蛋白。一些蛋白质含有非蛋白成分，如酶中的辅基和脂蛋白中的脂类。一级结构氨基酸的a-羧基与下一个氨基酸a-氨基缩合形成肽键，许多氨基酸以肽键相连形成的大分子多肽聚合物即为蛋白质。多肽有方向性，游离氨基端为N-端，游离羧基端为C-端。从N-端到C-端的氨基酸顺序即为多肽的一级结构。二级结构CN键具有部分双键性质，使得C=O与N=H四原子形成刚性

13、的肽键单元平面，肽键单元间以氢键相连，多肽链在空间折叠形成二级结构，常见的有a-螺旋和-折叠。三级结构二级结构进一步折叠形成多肽的三级结构。亲水基团位于蛋白质外侧，疏水基团埋在内侧，氢键、盐键、范德华力和疏水力维持结构的稳定。伴娘蛋白帮助蛋白质正确折叠。四级结构由多条多肽链（亚基）构成的寡聚蛋白，稳定三级结构的力量可将亚基维系在一起构成蛋白质的四级结构。如血红蛋白是由两个球蛋白链和两个球蛋白链构成的22四聚体。蛋白质的功能（参见教材P22）结构域和结构基序结构域是同一多肽中有限的高度有序结构片段相连而成。结构基序也称超二级 结构，是频繁出现在球蛋白中的二级结构元件群。蛋白质家族不同物种的具有相

14、同功能承担相同生化角色的蛋白质家族成员为直向同源。进化不同但功能相似的蛋白为共生同源。B3 Protein analysis (蛋白质分析法)蛋白质纯化有根据蛋白质大小进行分离的凝胶过滤层析；离子交换层析、等电聚焦和电泳则是根据蛋白质所带电荷的不同来分离。蛋白质测序用特异的蛋白酶或化学试剂将多肽切割成教小的肽段，然后在自动测序仪中用Edmen降解法从N-端开始测序。通过不同酶切割产生的重叠片段的重排再现原始序列。更为简单的方法是对蛋白质的互补DNA(cDNA)进行测序。测定分子量SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和质谱法是最常用的方法。蛋白质组学一个细胞在生存期或任何一个时间内转录表达的全套蛋白称为该细

15、胞的蛋白质组，对这些蛋白质的分裂鉴定和研究即为蛋白质组学。思 考 题与 作 业完成课后习题(参见教材P315-316)教学后记与生物化学联系有待加强。课时教案讲 授 人查幸福课时1.5序号3课题内容Properties of nucleic acid教学时间2007.09.10教学方法讲授教学课型理论 实验 习题实践 复习其它教学手段板书、多媒体教学目的1了解核酸的种类组成和结构2理解DNA双螺旋和超螺旋结构 3了解核酸理化性质，尤其是紫外吸收和变性重点难点核酸结构、核酸的理化特性教学内容备注C1核酸结构核酸是由核糖、碱基（嘌呤和嘧啶）、磷酸构成。碱基与核糖构成核苷，核苷与磷酸形成5/-核苷酸

16、。核酸有两类：DNA（脱氧核糖核酸）：由脱氧核糖、碱基（A、G、C、T）、磷酸形成的5/ -脱氧核苷酸构成。RNA（核糖核酸）：由核糖、碱基（A、G、C、U）、磷酸形成的5-核苷酸构成。在DNA和RNA分子中，核苷酸之间以3，5-磷酸二酯键连接形成长链大分子。核酸分子都有游离的5/端和游离3/端。核酸序列从左到右按5/端向3/端方向书写核酸的碱基序列，其中的核苷酸用单个碱基字母A、G、C、T或U代表。DNA双螺旋1953年沃森和克里克提出两条DNA分子相互缠绕形成右手双螺旋，螺旋有大沟和小沟戊糖-磷酸骨架位于分子外侧，双链间对应碱基靠氢键形成碱基对，其中A与T配对（2个氢键），G与C配对（3个

17、氢键）。双螺旋的每一匝螺旋含约10个碱基对。两条链反向平行排列。双螺旋的两条链为互补链，任意一条链的序列可确定另条链的序列，它暗示出DNA复制和转录的分子机制。A型、B型及Z型螺旋沃森和克里克提出的为B-DNA结构，是适用于所有DNA的稳定形式，碱基对与螺旋轴垂直，每匝10bp碱基对，有一条主沟和一条小沟。低温条件下，DNA可被诱导形成A型螺旋。A型与B型一样均为右手螺旋，但较宽而紧密，碱基对倾斜于螺旋轴，每匝为11个碱基对，A型的主要意义在于它是RNA及RNA与DNA杂合体的主要形式。在单一交替的嘧啶-嘌呤序列的合成双链DNA中，形成左旋Z-DNA，它有Z字型外观，每匝12碱基对，嘌呤核苷酸

18、形成顺式构象。RNA二级结构RNA 通常为单链，可以通过分子内氢键形成局部螺旋结构。C2核酸的理化性质氢键碱基堆积力和疏水作用维持核酸的稳定性。但在强酸条件下，核酸完全水解为碱基、核糖及磷酸，在略稀的酸中则产生脱嘌呤核酸。DNA化学测序法是用化学方法移去特定碱基或将DNA在特定碱基处断裂。碱性环境中嘌呤产生由酮式向烯醇式转化，导致氢键断裂，双链解离，DNA变性。一些化学物质能使核酸在中性PH下变性，如尿素和甲酰胺。DNA为细长分子，水溶液具有高黏性，机械力或超声波易损伤DNA，使其黏度下降。将DNA放入高浓度高分子盐溶液（如氯化铯）中高速离心，DNA最终沉降于与其浮力密度相应的位置，形成狭带，

19、这种技术称为平衡密度梯度离心或等密度梯度离心。DNA的沉降可用来确定其（G+C）含量和分离具有不同（G+C）含量的片段。C3核酸的光谱学和热力学性质紫外光吸收和减色性DNA和RNA最大紫外光吸收波长为260nm，与蛋白质的280nm相区别，用于核酸定性定量和纯化。单核苷酸光吸收值最大，其次是单链DNA（ssDNA)，双链DNA(dsDNA)最小，这种变化称为减色性。DNA纯度dsDNA的大致纯度可由A260/A280的比值来确定，纯dsDNA该值为1.8，纯RNA为2.0，蛋白质则小于1，如果DNA样品的A260/A280大于1.8，说明有RNA污染，小于1.8，说明含有蛋白质。变性和复性加热

20、使DNA 中氢键断裂，双链DNA的螺旋结构变成不规则的线团，称为DNA变性。变性核酸的紫外光吸收值增大，其变化值一半时对应的温度称为解链温度（Tm)，它随DNA中G+C含量的增加而增大。退火处理（慢速冷却）使得互补链互相配对，恢复双链结构为DNA复性。不同核酸链互补部分的复性称为杂交。C4DNA超螺旋闭环DNA大多DNA为闭环双链，两条链相互缠绕，缠绕的数目称为连接数（Lk)。分子中没有游离断。超螺旋超螺旋是DNA双链轴线的高度卷曲，如果扭曲方向与双螺旋方向相同，为正超螺旋，反之为负超螺旋。几乎所有细胞中的DNA都是负超螺旋。超螺旋的水平可以用连接数的变化（Lk）来衡量，如负超螺旋约6圈超螺旋

21、/100圈双螺旋，表示为Lk/Lk0=0.06。拓扑异构体碱基顺序相同但连接数不同的DNA分子称为拓扑异构体。缠绕和扭曲缠绕(Tw)是指双螺旋一股链绕另一股旋转；扭曲(Wr)则是双螺旋轴在空间的盘绕。Lk=Tw+Wr（参见教材P47）。嵌入剂如溴化乙锭能插到双螺旋的碱基对中，使之解旋。对负超螺旋分子，（负）扭曲减少，分子构型发生变化。超螺旋有扭转应力，比松散分子具有更高能量，对负超螺旋，这一能量有助于DNA螺旋的局部解旋。拓扑异构酶调控DNA超螺旋水平的酶称为拓扑异构酶。有两类：型在DNA一股链上产生一个切口，使另一条链得以穿越，连接数每次改变±1；型酶在双链上产生切口，使另一双链D

22、NA片段得以穿过，连接数每次改变±2。对所有的生物体，拓扑异构酶都是一种必要的酶，涉及复制重组和转录。思 考 题与 作 业DNA 双螺旋模型的主要内容是什么?教学后记讲超螺旋的时候,采用模型演示讲解效果较好.课时教案讲 授 人查幸福课时1.5序号4课题内容Prokaryotic and eukaryotic chromosome structure教学时间教学方法讲授教学课型理论 实验 习题实践 复习其它教学手段板书、多媒体教学目的1 理解原核生物和真核生物染色体的结构，掌握真核生物染色体结构特点2 理解核小体的组成及组蛋白的类型3 理解异染色质、CpG岛、C0t曲线及基因组复杂度的

23、含义重点难点原核生物的染色体结构、染色质结构、真核生物的染色体结构教学内容备注D1 原核生物的染色体结构原核生物的基因组可以大肠杆菌染色体为例，其为单一闭环DNA分子，集中分布在拟核区域内。生长时，DNA持续复制，生长速率最大时，每个细胞平价有基因组的两个拷贝。DNA有50100个环或结构域，各个结构域可保持不同水平的超螺旋，整个染色体为负超螺旋。结构域被非特异结合蛋白如HU和H-NS等类组蛋白缠绕，使一半超螺旋被束缚。RNA聚合酶及mRNA等有助于类核的组构。尚未发现核小体D2 染色质结构染色质真核生物 DNA总长度比原核生物大数千倍，并由一定数目分散的染色体组成，每条染色体中的DNA为单一

24、线性分子。染色质是紧密组装高度有序的DNA蛋白质复合体。组蛋白是染色质中主要的结合蛋白，分5类：H2A、H2B、H3、H4，以及H1。所有组蛋白带有大量正电荷，序列中20%30%由精氨酸和赖氨酸组成，这样组蛋白与带负电的DNA紧密结合。H1在不同种间在序列上比其他组蛋白具有更多的差异。核小体是染色质的基本构成单位。长约200bp，与由H2A、H2B、H3、H4各2分子构成的八聚体核心紧密结合有，以及1分子H1松散结合。除去H1，剩下与组蛋白八聚体结合的146bp的核小体核心。围绕核小体的DNA左手环绕形成负超螺旋（扭曲）。H1的功能H1与核小体结合，对DNA起稳定作用，免受核酸酶的降解。核小体

25、核心与H1构成染色小体。在有些细胞中H1可被极度变异的组蛋白H5所取代。连接DNA核小体间由连接DNA串联，平均长度为55bp，不同组织中其长度在0100bp内变化。30nm纤丝核小体进一步被组装成高度有序的左手螺旋（螺线管），即30 nm纤丝，每圈螺旋约6个核小体。高级结构30nm纤丝构成100kb的环，被蛋白和核基质所固定。D3 真核生物染色体结构有丝分裂染色体呈高度浓缩状态，两个姐妹染色单体在着丝粒处相连，染色体末端是端粒。酵母着丝粒仅由88bp长的富含AT的序列组成，而哺乳动物的着丝粒序列很长，其侧翼是大量的重复序列，即卫星DNA。端粒是染色体DNA末端特化的 序列，由大量的短重复序列

26、构成，由端粒酶合成。间期染色体在间期，染色体的基因被转录，DNA被复制，染色体呈松散状态。异染色质是间期染色体内保持高度浓缩的部分。它大部分由靠近着丝粒的重复卫星DNA构成，无转录活性。雌性哺乳动物的两条X染色体都呈异染色质状态。DNase 超敏性DNase 可切割裸露DNA，较长的敏感区域代表着那里正在进行转录，因此染色质对DNase 的敏感性可被用来定位细胞中具转录活性的染色质。CpG 甲基化哺乳动物DNA中5/CG3/序列通常在胞嘧啶碱基处被甲基化，它与染色质中的非转录区相连。基因组中还有未甲基化的CpG“岛”，包围着持家基因的启动子区域，形成DNase 敏感区。组蛋白变异体和修饰被包装

27、的染色质的快速变化可通过组蛋白的化学修饰来调控，如核心组蛋白N端赖氨酸残基的乙酰化；而有丝分裂中染色体的浓缩伴随着组蛋白H1的磷酸化。D4 基因组复杂度非编码DNA复杂的真核生物基因组DNA是原核生物的1000多倍，但大部分不编码蛋白质，其编码区被内含子中断。这些非编码DNA大部分由多重拷贝组成，这些拷贝可以是串联重复的（如卫星DNA）或是分散于基因组中（如分散的Alu元件）。复性动力学DNA加热变性后在低浓度下复性，在一定时间内（t），DNA复性的比例由初始DNA浓度（C0）决定的。用剩余单链DNA的比例（f)对 C0 t作图，得到的曲线代表了DNA样品的复性动力学，即C0 t曲线。多个拷贝

28、的单链片段比单一序列的复性快。DNA复性速率可用光谱法（紫外吸收值降低）和羟基磷灰石层析法测量。人类DNA复性分3个阶段：高度重复中度重复）单一序列。E.coli的复性仅有一个阶段。单一序列DNA在单倍体基因组中只有一个或几个拷贝的序列。在E.coli基因组中，所有DNA都是单一序列，但由于DNA较短，其复性较快， C0 t值相对较小。串联基因簇由串联重复的基因或基因簇构成中度重复DNA区段。如rRNA基因和组蛋白基因簇，18S、5.8S 、28S rRNA基因及间隔区组成的单位在DNA链上串联重复约5000次，这些基因位于核仁区。5个组蛋白基因同在一个基因簇，串联重复达数百次。分散重复DNA

29、中度重复DNA大部分由短散布元件（SINES，有几百个碱基）和长散布元件（LINES有几千个碱基）重复上千次构成，并分散于基因组中。如Alu 元件和L1元件，它们几乎占了人类基因组的10% 。卫星DNA由极短的序列高度重复串联排列而成，在CsCl密度梯度离心中，在主带DNA附近出现的卫星带。卫星DNA又分小卫星DNA（不确定数目串联重复，VNTR）和微卫星DNA（简单串联重复，STR），前者出现在染色体末端，后者则平均分布在染色体上。鉴定亲缘关系的DNA指纹技术的基础就是小卫星DNA的重复排列。基因多态性基因或基因座上碱基变化能使该基因座产生多种形式。思 考 题与 作 业什么是卫星DNA.?教

30、学后记在复性动力学部分要讲更易懂些.课时教案讲 授 人查幸福课时3序号5课题内容DNAreplication教学时间2007.09.21教学方法讲授教学课型理论 实验 习题实践 复习其它教学手段板书、多媒体教学目的1 理解DNA复制的半保留机制和半不连续复制2 掌握细菌DNA复制过程及有重要作用的酶和蛋白质3了解细胞周期4 了解真核生物DNA复制的特点重点难点原核和真核生物的复制机制教学内容备注E1 DNA复制概述半保留机制DNA两条亲代链分别作为模板催化新生子链的合成，新生DNA的一条链是原来的旧链，另一条是新合成的，为半保留复制。Meselson 和 Stahl (1958年)用实验证明了

31、该机制（见教材P71）。亲代链分开及新生DNA开始复制处称为复制叉。DNA合成的底物是脱氧核苷三磷酸（dNTP ）:dATP dGTP 、 dCTP、 dTTP 。合成的能量来自 dNTP的水解。复制子、复制起始与终点以单一单位复制的任一段DNA都称为复制子。每个复制子都有固定的起始点，原核生物许多病毒的DNA 呈环形，为单一复制子，通常两个复制叉从一个起始点向两个方向复制，复制的起始和细胞生长周期调节都在起始点处调节。真核生物的线性染色体由多复制子构成，每个复制子都有自己的起始点，起始点在最初解链处富含AT序列，它比富含GC的起始点更易解链。半不连续复制由于DNA新链合成只允许以5/3/方向

32、 进行，而两条亲本链反向平行，因而一条新链从起始点按 5/3/方向连续合成（前导链），另一条新链（后随链）从复制叉开始按 5/3/方向先合成一些短的DNA片段（冈崎片段），再由连接酶连成一条连续的DNA。即前导链连续合成为长链，后随链则是间断合成的，这种合成方式为半不连续复制。RNA引导在每一片段的5/ 端先合成一小段RNA（引物），引导DNA合成。E2 细菌的DNA复制起始E.coli的起始点位于遗传基因座 oriC，大肠杆菌编码的蛋白 DnaA首先识别和结合于 oriC的9bp重复序列形成复合物，约45bp成为单链， DnaB进入，它是DNA解旋酶，利用ATP水解产生的能量解开双链DNA，

33、形成的单链泡被单链结合蛋白Ssb所覆盖。DNA引发酶结合到DNA上并合成引物RNA。解旋DNA解旋酶沿模板链前进，打开双螺旋使复制顺利进行，在闭环DNA中复制叉处解旋所形成的正超螺旋可通过型拓扑异构酶即DNA旋转酶的作用而释放。延伸DNA聚合酶的全酶二聚体引发体和DNA解旋酶结合成复合体（复制体），以每秒900bp的速率合成DNA。引发体含有 DnaB解旋酶和DNA引物酶，在后续链上间断合成RNA引物。DNA聚合酶催化合成DNA，该酶含有聚合酶亚基和一个3/5/外切核酸酶亚基。DNA聚合酶负责切除引物并填补缺口，该酶具有5/ 3/ 聚合酶、5/ 3/ 外切核酸酶及3/5/校正外切核酸酶活性。D

34、NA连接酶填补片段间的缺口。终止与分离两个复制叉在 oriC约1800的对面相遇。该区域有终止子位点，它们与 DnaB抑制剂（tus基因的产物）结合，阻止复制叉移动。复制结束后两个相扣的子链DNA由拓扑异构酶（一种型拓扑异构酶）解联，分配到两个子细胞。E3 细胞周期细胞周期细胞分裂为两个子细胞的全部过程为细胞周期，它包括DNA的复制和细胞分裂。细胞周期分4个时期：G1期细胞为复制作准备；S期DNA复制；G2期S期后有丝分裂前的短暂期；有丝分裂期染色体对等分配到两个子细胞，它又有前、中、后期之分。G1 、S、G2 共同组成间期。有丝分裂后，增殖的细胞进入下一个细胞周期的G1期，也可脱离细胞周期进

35、入非增殖的休眠状态G0期（沉默期）。检验点及其调控在G1期有决定细胞进入下一个分裂周期的限制点（R点），细胞分裂周期起始还需促细胞分裂原，若细胞在到达R点之前缺乏促细胞分裂原，细胞将重进G0期。细胞周期中终止细胞分裂的那些点叫检验点，它在间歇期发生以保证细胞分裂之前完成DNA复制。细胞周期蛋白和CDK蛋白磷酸化是调控细胞周期进程的一个主要机制，由一个调节亚基（细胞周期蛋白）和依赖细胞周期蛋白的激酶（CDK）来完成，细胞周期蛋白CDK复合物决定将被磷酸化的目标蛋白。E2F和RB的调控由G1期进入S期主要依靠对E2F这一转录因子的激活，E2F的活性又受与其结合的蛋白RB的抑制，在G1中后期，细胞周

36、期蛋白CDK复合物使RB磷酸化从而释放E2F进而激活转录。细胞周期的激活、抑制和癌症小的抑制蛋白如CIP蛋白和INK4蛋白可通过抑制细胞周期蛋白CDK复合物的活性来延迟细胞周期的进程。细胞周期与癌症间有着根本的联系，G1到S期的过渡受到原癌基因和抑癌蛋白的调控。B细胞的癌变与细胞周期蛋白D1基因的过表达相关。人类癌症中两个重要的抑癌基因产物抑癌蛋白RB和P53均与细胞周期调控密切相关，RB调控E2F的活性，当DNA损伤时，P53诱导P21 WAF1/CIP1的合成。E4 真核生物的DNA 复制实验系统仅有400个复制子的酵母，更为简单的猿猴病毒（SV40）病毒都是很好的模型。非洲爪蟾卵提取物广

37、泛用于外加DNA或整个细胞核的复制。起始点和起始约2050个复制子串联成簇在S期同时开始复制，常染色质先复制，其次为异染色质，最后是着丝粒和端粒。酵母的起始点都有一个11bp长的保守序列（自动复制序列ARS），它可结合起始点识别复合体（ORC），被CDK激活后引导DNA复制。每个复制子仅起始一次，特许因子在作用后失活能防止复制的再次起始。复制叉真核生物复制叉移动速度为每秒50bp，该过程需要解旋酶、单链结合蛋白（复制蛋白A）和3种DNA聚合酶。聚合酶引发复制的起始，聚合酶延伸前导链，聚合酶完成后续链的复制。DNA及复制所需的蛋白质均固定在核基质上。端粒的复制真核染色体末端（端粒）由多个简单重复

38、序列构成，不带遗传信息，且3/端突出于5/端以防止半不连续复制不能复制线性染色体末端而造成遗传信息的丢失。端粒酶负责端粒DNA的复制，它带有与端粒重复序列互补的RNA分子。该酶在体细胞中处于抑制状态，但在许多癌细胞中处于激活状态。思 考 题与 作 业什么是半保留机制, 什么是半不连续复制, 复制的主要过程有哪些?教学后记这个部分是分子生物学的重要章节,要讲仔细.课时教案讲 授 人查幸福课时3序号6课题内容DNA damage, repair and recombination教学时间2007.09.28教学方法讲授教学课型理论 实验 习题实践 复习其它教学手段板书、多媒体教学目的1 了解突变的

39、种类和产生的因素2 理解DNA复制忠实性的机制3 掌握DNA修复的机制4 掌握DNA重组的方式及原理重点难点DNA突变、修复、重组教学内容备注F1 诱变突变指DNA碱基序列发生的永久的可遗传的改变。一个单一碱基的改变为点突变，它包括转换（嘌呤与嘌呤，嘧啶与嘧啶间的互换）或颠换（嘌呤与嘧啶间的互换）。如果点突变发生在DNA的非编码区、非调节区或密码子的第3个碱基，它不会影响渗入蛋白质中的氨基酸，为沉默突变；如果发生氨基酸的改变，则为错义突变。形成新的终止密码的突变为无义突变，产生截短的蛋白质产物。一个或多个碱基的增加或丢失，会引起移码突变。群体中许多沉默突变及非致死性突变的积累会产生遗传多态性。

40、复制忠实性复制的精确性有3种机制：互补碱基配对原则（模板链和进入核苷酸在DNA聚合酶的作用位点正确配对）；聚合酶的3/5/外切酶活性有校对功能，它能回走从3/端切掉错配核苷酸，引物是DNA聚合酶发挥自我校正功能的必要条件；逃脱校对的错误可被错配修复机制所纠正。诱变剂常见的物理诱变剂为紫外线，它引起相邻嘧啶核苷酸产生嘧啶二聚体。化学诱变剂种类很多，碱基类似物可改变碱基配对特性，诱发直接突变（如5溴尿嘧啶是胸腺嘧啶的类似物）。亚硝酸使胞嘧啶脱氨变成尿嘧啶，引起复制中AT向GC转化。烷化剂能在DNA不同位置加上烷基，造成碱基脱落，经修复才能防止DNA损伤，细胞对损伤的处理有可能会由于间接诱变而导致突

41、变。直接诱变和间接诱变DNA中存在稳定的、配对特性发生改变的碱基而导致的突变为直接诱变；在有些情况下，一些损伤DNA聚合酶为了保证染色体的完整性在损伤对应的位点上插入错误的碱基，导致间接诱变；突变发生在损伤的位点上为定点突变，发生在其它位点为非定点突变。原核生物中转移损伤DNA合成属于对DNA损伤的SOS反应（有时也叫“易错修复”）F2 DNA损伤碱基的损伤和丢失DNA的一些损伤是自发的，如胞嘧啶会自发水解脱氨变为尿嘧啶，它会在接下来的复制中与腺嘌呤配对。生理温度下，哺乳动物的基因组每天约失去10000嘌呤和几百个嘧啶。许多已改变的碱基会被专一性的DNA糖基化酶所除去，形成无嘌呤和无嘧啶位点或

42、AP位点。氧化性损伤自由基可攻击DNA，产生氧化产物造成氧化损伤烷基化烷化剂为亲电化学试剂，可将烷基加到核酸的各种位点，导致DNA损伤。有些是致死性的，多数导致间接诱变损伤。聚化加合物紫外线使相邻嘧啶，尤其是胸腺嘧啶形成环丁烷嘧啶二聚体；煤焦油中的苯并芘在肝脏产生的一种产物可与鸟嘌呤残基共价结合；芳香族烷化剂、黄曲霉毒素B1均可与DNA共价结合。F3 DNA修复光复活DNA中的嘧啶二聚体可通过可见光的光解作用而恢复为单体，催化此过程的酶是DNA光解酶（光复活酶）。E.coli的光解酶有两个发色团：蝶呤和FAD。这是一种无差错的“直接修复”。烷基转移酶该酶可直接从突变的O6烷基鸟嘌呤上除去烷基，

43、酶作用后即失活。它也属于无差错直接修复。切除修复为普遍的无差错的修复机制。有两种形式：核苷酸切除修复（如E.coli中的UvrABC内切核酸酶识别并切除嘧啶二聚体和其他大块损伤，缺口可由DNA聚合酶和连接酶填补）；碱基切除修复（专一的DNA糖基化酶识别修饰碱基，切除修饰碱基与糖基间的N糖苷键，留下一个脱嘌呤或脱嘧啶的AP位点，AP内切核酸酶在该位点切开DNA。错配修复是一种特殊的切除修复，它是按模板的遗传信息来修复错配碱基的，因此修复时首先要区别模板链和新合成的DNA链。它通过碱基的甲基化来实现的。大肠杆菌DNA的5/GATC序列中A的N6都是甲基化的（Dam甲基化酶负责），复制后的一个短暂时

44、间内，新合成链的GATC中的A 未被甲基化，故子代DNA暂时是半甲基化的，这是识别的基础。错配的碱基被MutS和 MutL组合的复合体识别并与之结合，再与 MutH内切核酸酶结合，后者在子代链GATC附近的位点上产生缺刻，启动对损伤区的切除修复。遗传性非息肉结肠癌就是一种错配修复酶突变丢失引起的。着色性干皮病（XP）患者缺乏对紫外线引起的大块DNA损伤的切除功能，对阳光极度敏感，易患皮肤癌F4 重组同源重组也称一般重组，即两个双螺旋DNA分子间同源序列进行交换。双倍体真核生物发生在减数分裂过程，非姐妹染色单体交换相对应的区域，产生的单倍体配子会包含父母本两方的遗传信息。单倍体细菌也可重组，如发

45、生在部分已复制DNA间或染色体DNA与外源DNA（质粒或噬菌体）间。重组的过程和机制包括断裂复合、异源双链、分支迁移、Holliday结构、拆分（见教材P98图）。大肠杆菌的核酸酶和RecBCD结合在 chi序列上并产生切口形成单链末端，单链DNA被 RecA蛋白包裹，4条单链形成Holliday结构。同源重组对DNA修复也很重要（复制后修复或重组修复）。位点特异性重组非同源DNA的特异片段间的交换，它是在结合序列部位由特异的酶来催化断裂重接，而同源重组则是由能与RecA蛋白结合的DNA序列随机断裂引发的。噬菌体可将自身基因组插入大肠杆菌染色体的特定位点，噬菌体编码的整合酶与细菌编码的整合宿主

46、因子（IHF）促成重组结果和DNA进入宿主染色体。噬菌体编码的切除酶被激活时，整合作用发生逆转，DNA脱离细菌基因组。在真核生物中，免疫球蛋白有3个基因段编码重链和轻链的可变区：V、D和J。这些基因段间的重组产生大量的不同重链和轻链基因序列，导致抗体种类的多样化。转座作用又称非常重组，一些短的DNA片段（转座子或转座元件）可转移进基因组的几乎任何位置。转座子均有两个结构特征：两端有2040bp的反向重复序列；具有编码转座酶的基因，该酶催化转座子插入新的位置。E.coli中的IS元件（插入序列）是最为简单的转座子。Tn转座子系列除了转座酶，还携带其它基因（如抗性基因），其中的内酰胺酶可使生物体抗

47、青霉素。酵母中的Ty元件编码的蛋白与反转录病毒的反转录酶和整合酶相似，Ty元件两侧为长末端重复序列，它先转录成RNA再反转录到DNA双螺旋中，然后插入到其它地方，果蝇的copia转座子与其相似，称为反转录转座子。高等真核生物中的一些分散重复序列（如LINES和SINES）很可能是通过转座作用在基因组内传播的。思 考 题与 作 业 DNA修复有哪些类型?机制各是什么?教学后记DNA修复机理用模型来讲解会清楚一些。课时教案讲 授 人查幸福课时3序号7课题内容Gene manipulation教学时间2007.10.05教学方法讲授教学课型理论 实验 习题实践 复习其它教学手段板书、多媒体教学目的1

48、 了解DNA克隆及常用宿主和载体2 掌握基因组文库和cDNA文库3 掌握DNA克隆的一般步骤重点难点DNA克隆策略及其基本方法教学内容备注G1 DNA克隆概述DNA克隆将生物体基因组DNA片段作为自主复制载体的一部分进行独立复制，对其进行分离和操作即为DNA克隆。基因组的较小片段连接到一段可以自主复制的DNA（载体）上，形成重组DNA，带有重组DNA的宿主细胞增殖构成一群具有遗传一致性的个体为单克隆。宿主和载体载体应具有整合特性、独立复制特性和易被筛选的选择标志，常用的载体有细菌质粒、噬菌体（噬菌体和噬菌体M13）和一些病毒，还有人工改造的载体如黏粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体等。常用宿主

49、有大肠杆菌和酵母菌。亚克隆将已克隆的DNA片段从一载体向另一载体转移的过程为亚克隆 。它可用来对较大的克隆片段上的较短区段进行仔细研究。DNA文库是一套DNA克隆，它是带有不同DNA片段的载体在宿主中扩增后的产物。由基因组DNA构建的为基因组文库，由细胞mRNA经反转录合成的cDNA插入载体构成cDNA文库。筛选含有目的基因的克隆通常用DNA探针经杂交来测出，并用限制性酶切图谱来分析DNA片段。G2 质粒DNA的制备质粒载体大肠杆菌的质粒是染色体外的环状DNA，有复制起点（ori ），能独立复制，含有抗生素抗性基因（bla 或ampr 基因抗青霉素，tetA基因抗四环素）。是常用的载体。质粒的

50、制备碱裂解法最常用：菌体沉淀悬浮于缓冲液中，加入含有SDS的氢氧化钠溶液使DNA变性RNA水解，再用高浓度pH5的乙酸钾沉淀变性蛋白质和染色体DNA，离心，上清中含质粒DNA。用酚抽提法除去残余蛋白，留在水相中的DNA和RNA可由乙醇沉淀得浓缩并用核糖核酸酶A降解残余RNA。也可用氯化铯密度梯度离心纯化，这是获的极纯的超螺旋质粒DNA的最佳方法。G3 限制酶与电泳限制性内切核酸酶 细菌含有限制修饰系统，有两个主要组分：限制性内切核酸酶（识别一小段对称的DNA序列，在识别位点处切割）和甲基化酶（对细胞DNA识别序列内的C或A加上一个甲基，保护宿主细胞DNA不被内切酶降解）识别序列限制性内切核酸酶

51、仅识别6bp的回文序列，在该位点酶切DNA形成两个片段，每个片段有5/ 突出末端（带磷酸基团）和带游离羟基的3/ 端。黏末端限制性酶解反应产物的突出末端被称为黏末端，它可与其它任何具有相同突出序列的末端结合。酶解切割的DNA片段可用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳来分离。G4 连接、转化、与重组体分析DNA连接来自T4噬菌体的连接酶可将目的基因与载体的黏性末端退火碱基断裂的磷酸二酯键闭合。重组DNA分子目的基因插入载体DNA的酶切位点处形成的环状分子为重组DNA分子。转化重组体进入宿主（大肠杆菌）一般采用转化方式，用Ca2+ 处理大肠杆菌，细胞易吸收外源DNA，这一过程为转化，预处理的细胞被称为感

52、受态细胞筛选感受态细胞在琼脂平板上生长出的克隆大多不含质粒，要对含质粒的克隆进行筛选，通常利用质粒含有的抗性基因来筛选。筛选的转化子进行增殖保存和分析。思 考 题与 作 业DNA克隆的主要过程有哪些?如何鉴定阳性克隆?教学后记讲一些DNA克隆的实例更能帮助学生理解课时教案讲 授 人查幸福课时3序号8课题内容Cloning vector教学时间2007.10.12教学方法讲授教学课型理论 实验 习题实践 复习其它教学手段板书、多媒体教学目的了解和熟悉常用的适用于各种用途的克隆载体重点难点质粒载体的设计、噬菌体载体教学内容备注H1 Design of plasmid vectors (质粒载体的设

53、计)克隆过程中最重要的步骤之一就是鉴别环化载体分子与重组质粒,已形成了许多方便于鉴定的方法。当载体分子上具有双抗生素抗性基因时，就可以用插入片段插入某个抗性基因而使其失活的方式来筛选重组体。质粒上的lacZ基因的插入失活被用来在含有IPTG和X-gal的平板上筛选重组体。多克隆位点即具有多个限制酶酶切位点的一段DNA序列，为选择限制酶或克隆中所使用的酶提供更多的选择性。许多载体被设计成使插入片段内的基因可从强启动子起始转录并表达。如用T7表达载体。H2 Bacteriophage vectors噬菌体对大肠杆菌的侵染以及随后的细胞裂解过程可用来扩增克隆的DNA片段。将目的DNA片段连接于侵染所

54、必须的基因的末端，形成重组噬菌体DNA。经过包装与侵染，最后噬菌体斑形成。M13噬菌体在大肠杆菌细胞内以双链环状形式复制，可以像质粒一样操作，但产生的噬菌体颗粒内仅含有环状ssDNA。H3 Cosmids, YACs and BACs真核生物基因和基因组结构的分析需要比质粒和噬菌体更能容纳大片段DNA载体。经常使用的有黏粒载体、酵母人工染色体和细菌人工染色体等。H4 Eukaryotic vectors许多基因克隆的应用都需要将基因转入真核细胞并获得表达。转染真核细胞可以采用电穿孔、微注射和固体粒子轰击。经常使用的载体有穿梭载体、酵母附加型质粒、根癌农杆菌Ti质粒、杆状病毒和哺乳动物病毒载体等

55、。思 考 题与 作 业常用的载体有哪几类？性质、插入片段大小等如何？表达载体与克隆载体的有哪些不同？教学后记学生反应内容较抽象。课时教案讲 授 人查幸福课时3序号9课题内容Gene libraries and screening教学时间2007.10.19教学方法讲授教学课型理论 实验 习题实践 复习其它教学手段板书、多媒体教学目的1 了解基因文库的种类及区别2 掌握基因文库基本的制作方法重点难点基因组文库、cDNA文库制作教学内容备注I1 基因组文库基因文库某生物不同DNA序列的总集构成基因文库，它包括基因组文库和cDNA文库，基因组文库 的DNA来自基因组，由细胞mRNA经反转录形成的互补DNA（ cDNA）构成的为 cDNA文库。cDNA文库不包括不能转录的核基因序列文库大小计算公式见P140基因组DNA纯化的基因组DNA需要用物理剪切或限制性酶解切割成载体适用的片段（1525K