端粒酶活性检测方法的研究进展

1、端粒酶活性检测方法的研究进展    摘要: 近几年研究表明端粒酶与肿瘤的发生发展密切相关，推测可能是一个广泛的肿瘤标志物。本文就端粒酶活性检测的原理，端粒酶的提取方法，TRAP扩增技术，四种结果分析方法（同位素法、染色法、荧光法和ELISA法）以及如何进行质量控制与半定量测定进行综述。 端粒酶（Telomerase）是由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白酶。人端粒酶RNA组分（hTR）于1995年被克隆，其中含有端粒重复序列的模板（5-CUAACCCUAAC-3）；蛋白质组分具有RNA依赖的DNA多聚酶活性，结构尚不清楚。端粒酶能以自身RNA的模板区为模

2、板复制合成端粒序列。在胚性细胞等增殖活跃的细胞中具有端粒酶活性，而在正常成熟体细胞中端粒酶失活，同时还发现绝大多数肿瘤细胞都呈端粒酶阳性，而在癌旁组织和正常组织阳性率很低，推测端粒酶可能是一个广泛的肿瘤标志物1。因此近几年端粒酶在各种肿瘤中的研究日益深入，同时促进了检测方法的改进与完善。本文对其检测方法综述如下。 1 基本原理 端粒酶在体外可以以其自身RNA的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添加6个碱基的重复序列，用聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳可显示6个碱基差异的梯带。1994年Kim建立了基于PCR基础上的端粒重复序列扩增法（telomeric repeat amplificatio

3、n protocol, TRAP）。TRAP反应原理见下图。   首先合成一个18nt的TS做上游引物，端粒酶结合TS末端的GTT并合成agggttag，然后每经过一次转位合成一个ggttag的6碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入一个24nt的CX做下游引物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。 2 基本技术方法 2.1 标本来源 手术摘除组织，针吸活检组织，胸水，腹水，膀胱或胰管冲洗液，棉拭子所取分泌物和尿液（尚有争议）等。 2.2 端粒酶的提取方法 早期采用超声等物理破碎的方法在不同细胞中的提取效率差异较大，此后采用去污剂（如CHAPS）裂解的方法在少量细胞获取了较稳定的

4、端粒酶提取液。现详述如下：40100mg冷冻（-70）组织或104106沉淀细胞用冰预冷的洗液10mM hepes-KOH(pH7.5), 1.5mM MgCl2, 10mM KCI, 1Mm DTT洗1次，10000g4离心1min，沉淀加200l冷裂解液10mM tris-HCI(Ph7.5), 1mM MgC12,1mM EGTA, 0.1mM PMSF, 5mM -巯基乙醇，0.5CHAPS，10甘油，自动匀浆器冰浴中匀浆，450rpm,25min, 16000g4离心20min，移取上清160l，部分样品用于蛋白定量，其余迅速冷冻，-70保存。端粒酶经小于10次冻融可保持活性稳定。部

5、分学者对某些标本用0.5Tween-20代替0.5CHAPS获得更好的效果 参考文献 1 Kim NW, Piatyszek MA, prowse KR, et al. Science, 1994；266:2011 2 Miura N, Horikawa I, nishimoto A, et al. Cancer Genet Cytogenet, 1997；93:56 3 Broccoli D, Young JW, lange T, et al. Cell Biol, 1995；92:9082 4 Brien TP, Kallakury BV, lowry CV, et al. Ca

6、ncer Res, 1997；57:2760 5 Chadeneau C, Hay K, Hirte hW, et al. Cancer Res, 1995；55:2533  6 Pao BC, Tseng CJ, Lin CY, et al. J Clin Oncol, 1997；15:1932 7 Kyo S, Takakura M, ishikawa H, et al. Cancer Res, 1997；57:1863 8 Heine B, Hrmmel M, Mller m, et al. J Pathol, 1998；184:71 9 Ohyashiki JH, Ohyas

7、hiki k, Sano T, et al. Jpn J Cancer Res, 1996；87:329 10 Suda T, Isokawa O, aoyagi Y, et al. Hepatology, 1998；27:402 11 Iwama H, Ohyashiki K, ohyashiki JH, et al. Hum Genet, 1998；102:397 12 Ohyashiki K, Ohyashiki JH, nishimaki J, et al. Cancer Res, 1997；57:2100 13 Wright WE, Shay JW, piatyszek MA, et

8、 al. Nucleic Acids Res, 1995；23:3794 14 Linn JE, Lango M, halachmi S, et al. Int J Cancer, 1997；57:2144 15 Umbricht CB, Saji M, westra WH, et al. Cancer Res, 1997；57:2144 16 Lin Y, Vemura H, fujinami K, et al. J Urol, 1997；57:1161 17 Kojima H, Yokosuka O, imazeki F, et al, J Urol, 1997；157:1161 18 Tsutsumi M, Tsujiuchi T, ishikawa O, et al. Jpn J Cancer Res, 1997；88:931 19 Hiyama E,