移植的神经干细胞在脑损伤区壳聚糖载体中的存活与分化

1、移植的神经干细胞在脑损伤区壳聚糖载体中的存活与分化                作者：衣昕，毛伟峰，田美玲，秦建兵，金国华   【摘要】  目的：探讨移植的NSCs在大鼠脑损伤区壳聚糖载体中的存活、分化情况及其对TBI大鼠认知功能的影响。方法：低温冷冻干燥法制备壳聚糖多孔支架。将从鼠胚前脑中分离的NSCs扩增、标记BrdU。Feeney法制备SD大鼠TBI模型，随机分为3组：损伤对照组清创后不做移植；NSCs+支架移植组行壳

2、聚糖作载体的NSCs移植；NSCs+支架+ NGF移植组行壳聚糖作载体的NSCs移植，并在其中加入NGF。术后1、2、3个月行避暗回避和跳台试验。脑切片行Nissl染色、BrdU与NF-200免疫荧光双标染色。结果：两移植组的认知功能在术后1、2、3个月较损伤对照组明显改善，含NGF的移植组改善更加显着。两移植组术后1、2、3个月在移植区均可见BrdU与NF-200免疫荧光双标细胞，含NGF移植组中的双标细胞数量多、胞体大、突起多且长。结论：大鼠TBI后移植的外源性NSCs可以在脑损伤区壳聚糖载体中长期存活并向神经元分化，可以改善大鼠的认知功能；NGF对其具有促进作用。 【关键词】 

3、 创伤性脑损伤；壳聚糖； 神经干细胞； 移植；神经元；神经生长因子   Abstract   Objective: To explore the survival and differentiation of transplanted NSCs in the chitosan porous scaffold within the cerebral cortex lesion of rats and the influence on the cognitive function of rats with TBI. Methods:  The po

4、rous chitosan scaffold was made by Freezing-drying technique. The NSCs coming from rat fetal forebrain were labeled with BrdU. Sprague-Dawley(SD) rats TBI models were made by Feeneys method. The TBI rats were randomly divided into injury-control group, NSCs+scaffold group and NSCs+scaffold+NGF group

5、. The rats were immediately debrided after injury, then NSCs combined with the chitosan porous scaffold were transplanted into injured cerebral cortex in NSCs+ scaffold group, NSCs combined with the chitosan porous scaffold and NGF were transplanted into injured cerebral cortex in NSCs+ scaffold +NG

6、F group. Rats were tested for cognitive function using step-through and step-down test at 1, 2 and 3 months postop. Nissl staining and NF-200/BrdU double immunofluorescence were used for brain sections. Results:  Significant improvement in cognitive function was observed after transplantation i

7、n two transplanting groups, and the cognitive function improvement of rats in NSCs+scaffold+NGF group was more obvious than that of rats in NSCs+scaffold group. NF-200 and BrdU double-labeled cells were detected in the transplantation zone of two transplanting groups at 1, 2 and 3 months postop. The

8、 number of BrdU and NF-200 double-labeled cells with more and longer processes in NSCs+scaffold+NGF group was more than that in NSCs+scaffold group. Conclusions:  Transplanted NSCs can survive for long time and differentiate into neurons in the chitosan porous scaffold within the cerebral corte

9、x lesion of rats with TBI, which can improve the cognitive function of rats. Ectogenic NGF can accelerate all these changes.   Key Words   Traumatic brain injury; Chitosan; Neural stem cells; Transplantation; Neuron; Nerve growth factor   创伤性脑损伤（traumatic brain injury,

10、TBI）是以细胞丢失为主要特征的进行性退行性病变1，中枢神经系统（central nervous system, CNS）损伤后的再生一直是困扰人类的难题。神经干细胞（neural stem cells，NSCs）因具有自我更新、多分化潜能等特性，为移植NSCs治疗TBI提供了广阔的应用前景。本文通过Feeney法（1981）建立大鼠TBI模型，清创后行壳聚糖作载体的NSCs移植治疗，检测NSCs在大鼠脑损伤区壳聚糖载体中的存活及和移植NSCs对TBI大鼠后认知功能的影响，为应用NSCs移植治疗TBI提供理论和实验依据。   1   材料与方法 

11、;  1.1   动物与分组   220240 g SD大鼠54只（本校实验动物中心提供），雌雄不拘，随机分为损伤对照组、NSCs+支架移植组和NSCs+支架+NGF移植组各18只，每组又分为术后1个月、2个月、3个月 3个时相点，每组各时相点均为6只。   1.3   TBI模型制备   参照Feeney TBI模型法，动物经腹腔注射复合麻醉剂Chlorpent（0.2 ml/100g）麻醉后，将头部固定于立体定位仪，颅顶剃毛、消毒，切开头皮直至颅骨外骨膜，以前囟后方3.5 mm 、

12、左侧2.5 mm 为中心，用手术刀切除一边长为5 mm的正方形骨瓣形成骨窗，保持硬脑膜完整。在骨窗上方垂直固定Feeneys模型打击装置，致伤高度25 cm，致伤物重20 g，致伤力度为500 g·cm。   1.4   损伤对照组处理   损伤对照组致伤后，立即切开硬脑膜，进行清创处理，消毒生理盐水冲洗后，缝合切口，青霉素10万U肌肉注射，动物清醒后按性别分笼饲养。   1.5   NSCs移植   1.6   行为学检测  

13、; 测试仪器和方法同金国华等报道。制备TBI模型前经避暗回避试验检测，3组大鼠的行为学无差异。术后1、2、3个月进行（1）避暗回避试验：记录3组大鼠第3 d的探索次数和第6 d的滞留时间；（2）跳台试验：避暗回避试验结束后进行，记录第7 d的主动和总回避阳性率。   1.7   脑组织切片的制备   行为学检测完毕，大鼠经上述方法麻醉后，开胸经心先后灌注生理盐水100 ml及含有4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS 400 ml，取脑后固定6 h。再分别经20%、30%蔗糖平衡，行冠状位冰冻连续切片，片厚20 m。共收集2套切片，

14、均贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上待染色。   1.8   切片染色     1.9   图像处理和统计学方法   将NSCs+支架移植组、NSCs+支架+ NGF移植组摄取的荧光照片导入计算机中，利用捷达801系列形态学分析软件计数移植区200倍视野内BrdU与NF-200免疫荧光双标阳性细胞数、胞体面积和细胞（包括突起）周长。每只大鼠均取4张切片相应部位的平均值作为统计数据。   采用Stata7.0统计软件，对3组大鼠避暗回避试验的探索次数和滞留时间以及

15、跳台试验的主动和总回避阳性率行方差分析；对两个不同移植组BrdU与NF-200免疫荧光双标阳性细胞数、胞体面积和细胞周长行t检验。            2   结   果   2.1   行为学检测     2.2   Nissl染色   损伤对照组创伤区可见到烧杯状缺损，创伤侧海马严重萎缩变形，见海马CA3区及齿状回细胞排列紊乱、丢失

16、。两移植组创伤区有移植物填充，移植物中均可见到许多尼氏阳性细胞，术后3个月时移植物均已经与宿主整合，壳聚糖支架已经部分降解，创伤侧海马CA3区及齿状回的细胞虽有排列紊乱和丢失，但萎缩变形不明显。   2.3   BrdU与NF-200免疫荧光双标记   损伤对照组结果为阴性。两移植组中BrdU的标记呈红色，NF-200的标记呈绿色。相同视野不同激发光和吸收光波长下所摄取的照片经软件重叠处理可见移植区中BrdU与NF-200双标细胞的胞核呈红色，胞浆及突起呈绿色。NF-200阳性细胞BrdU绝大多数也为阳性。   术

17、后1、2、3月两移植组BrdU与NF-200免疫荧光双标细胞数、胞体面积、细胞周长以及统计分析结果见表3。   3   讨   论   以往TBI的治疗侧重于药物治疗以减轻急性期的继发性脑损伤和提高慢性进展期存活脑组织的功能，而应用NSCs治疗TBI只在最近才开始被研究。虽然NSCs存在于多个脑区，但自体NSCs应对脑损伤产生新神经细胞的能力有限，而且诱导脑区自体NSCs定向迁移与分化的研究尚未取得突破性的进展。因此移植外源性细胞治疗脑损伤成为主要的研究方向之一。可供移植的细胞种类很多，如永生化祖细胞、NSCs、胚

18、胎神经组织、骨髓基质细胞、脐血细胞、有丝分裂后神经元等，由于NSCs具有多向分化潜能、低免疫原性、取材容易、来源广泛等特点，因此在细胞移植治疗方面，无论从临床应用，还是伦理角度都显示出了更大的优势。   外源性NSCs在移植部位微环境中的存活是迁移、分化的前提条件。移植物的存活可能与移植细胞组织类型、移植途径、移植时间及部位等因素有关。为了更好地模拟临床治疗，避免造成二次损伤，本实验在创伤急性期即在损伤区行壳聚糖作载体的NSCs移植。在脑损伤急性期创伤侧的皮质、海马等结构中有许多引起继发性脑损伤的细胞因子或毒素的释放，但这些微环境表达的蛋白如nestin和cyclinD1等

19、为损伤区提供了类似于胚胎期的微环境，从而使得NSCs能够存活58，本实验中术后1、2、3个月均检测到BrdU标记的阳性细胞也证实了这一点。移植物的长期存活是移植成功与否的关键，本实验在移植术后3个月仍能检测到较多BrdU标记的阳性细胞，这可能与壳聚糖支架的应用不无关系，体外实验已证实壳聚糖具有良好的生物相容性，脑损伤区壳聚糖多孔三维支架为移植的细胞提供了获取营养、气体交换、排泄废物和生长代谢的场所，为形成新的具有形态和功能的组织提供了结构基础。同时，移植的NSCs可表达一些神经递质受体，CNS中的神经递质可促进NSCs的存活和增殖10。NSCs具有低免疫原性，脑又是相对的免疫豁免器官，从而有利

20、于移植细胞的长期存活。   研究认为外源性NSCs的分化是由局部微环境所决定的。NSCs能对周围的信号做出反应，如脑损伤后局部表达的白介素(interleukin, IL)能促进NSCs向神经元方向分化；碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor-basic，bFGF)、白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor , LIF)等能促进NSCs增殖；神经生长因子家族均有促进NSCs分化的作用11。而损伤局部神经胶质细胞的增生、脑局部组织间液类似血清的成份、神经营养因子减少或消失等各种综合环境均可诱导存活的NSCs

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