东才生物实验操作手册

1、目 录细胞培养2组织总RNA提取4RNA逆转录7普通PCR8胶回收9RT-PCR10同步RNA提取蛋白12蛋白提取13蛋白浓度测定13Western Blot配液14Western Blot步骤15Chip（染色质免疫共沉淀）17细胞培养试剂及仪器PBS（4保存）、培养基（4保存）、0.25% 胰蛋白酶（20保存）、胎牛血清（20保存）、封口膜、无菌枪头（白、蓝）、试管（10ml）、EP管盒、培养瓶、口罩、手套、帽子、培养皿（培养细胞和分离组织）、离心管、冻存管、过滤器、注射器、超净工作台、CO2培养箱（5%，维持PH值）、普通冰箱（培养用液、临时用血清、消化液）、-20冰箱（血清、酶类、抗体

2、、药品）、离心机（沉淀细胞）、电热鼓风干燥箱（烘干、灭菌）、压力蒸气消毒器、恒温水浴箱（56×30 min，灭活血清中的抗体）、倒置显微镜（观察细胞状态）、普通显微镜（细胞计数）、电子称、液氮灌。仪器处理及试剂配制1、 123 °C高压灭菌30min（枪头、试管），然后放入电热鼓风干燥箱烘干过夜。2、 培养基内加入10%胎牛血清。3、 培养基中加入1%双抗。4、 瓶口、瓶盖、镊子等使用前、使用后要在酒精灯上过火。注意事项1、 实验前检查培养箱温度和CO2浓度。2、 检查CO2瓶压力和剩余量。3、 临走时请确认关闭倒置显微镜。4、 血清可中和胰蛋白酶。5、 所有离心操作要用封

3、口膜封口。操作步骤组织细胞取材1、 常规处死动物（小白鼠断椎、大鼠吸入乙醚、兔子空气栓塞）。2、 浸泡在75% 酒精中。3、 解剖动物，用剪刀剪开皮肤，换一把剪刀取组织（取软骨保持其关节腔完整，周围带有软组织）。4、 组织放入超净工作台。5、 PBS洗涤 23 次。6、 换一把小剪刀，解剖出软骨组织（髋关节软骨帽）。7、 用剪刀剪碎至 1 mm3 左右。8、 加入0.25% 胰蛋白酶（56倍量）。9、 放入37水浴锅内或培养箱中消化（消化过程中间歇摇晃）。10、 待组织块疏松、色变白。11、 100目孔径过滤器过滤。12、 滤液移入离心管。13、 离心管用封口膜封口。14、 离心 800100

4、0 rpm×5 min。（平衡、盖离心机盖子）15、 弃去上清液。16、 加入培养液。17、 细胞计数。18、 稀释至50万/ml。19、 移入培养瓶。20、 瓶口喷75% 酒精消毒。21、 确认培养瓶盖已拧松。22、 放入CO2培养箱培养。23、 24h后倒置显微镜下观察细胞贴壁情况。细胞换液与传代1、 查看酒精棉球是否够用。2、 75%酒精擦拭超净工作台。3、 准备封口膜和废液缸放入超净工作台。4、 从20冰箱中取出胰酶，放在培养箱中融化。5、 取出PBS、培养基放在超净工作台。6、 打开超净工作台紫外灯，照射 30 min 60 min。7、 打开细胞房紫外灯，照射 30 mi

5、n 60 min。8、 关闭细胞房紫外灯。9、 关闭超净工作台紫外灯。10、 打开超净工作台照明灯，打开抽风。11、 点燃酒精灯。12、 75% 酒精擦拭倒置显微镜。13、 取出培养瓶，拧开盖后直接倒去培养基。14、 取PBS液 1 ml洗后倾去。15、 加入胰蛋白酶 1 ml，放回培养箱中消化 10 min。16、 加入 9 ml培养基。17、 用1ml吸力吹打细胞。18、 分装入两个新的培养瓶，拧上盖子。19、 倒置显微镜观察细胞。20、 瓶口75% 酒精喷雾消毒。21、 放回培养箱（盖子不要盖紧）。22、 收拾工作台，处理废物。超超净工作台紫外灯消毒 30 min。23、 确认倒置显微镜

6、已关闭。 种板与加药、固定1、 300l每片。2、 培养箱中温育约5 min。3、 加5 ml培养基。冻存与解冻1、 取冻存管。2、 DMSO。组织总RNA提取准备工作试剂及仪器DEPC水、瓶子（100 ml）、封口膜、滤纸（一张+N条）、Trizol、氯仿、异丙醇、无水乙醇、无RNA酶枪头（蓝、黄）、无RNA酶EP管（1.5 ml）、EP管盒、PCR管、眼科剪、镊子、匀浆机、口罩、手套、帽子。仪器处理及试剂配制1、180 烤箱烘烤6小时：瓶子（100 ml）、眼科剪、镊子2、提前一天进行编号转换并对两套EP管提前编号。3、剪封口膜。4、剪滤纸，并在紫外灯下照射。5、临时配制75%乙醇：按每个

7、样本 1 ml×2 次=2 ml 算（1 体积DEPC水 + 3 体积无水乙醇）。注意事项1、 Trizol有毒，注意自我保护。2、 在75% 乙醇中，RNA在 4至少保存1周，20至少保存1年。3、 注意环境要求流动性小，人员少。4、 最后加DEPC水溶解前，可将DEPC水先放在60温箱中温育，可加速溶解。5、 匀浆机最多可同时匀24管，离心机最多可离30管。操作步骤一、提抽（一）组织抽提1、组织从 80 冰箱中取出待溶解。2、取组织 50 mg于EP管（1.5 ml）中。3、加珠子 810 粒。4、加入 Trizol：200l。5、封口膜封闭EP管。6、置于匀浆机中（速度5，时间

8、4 min，4 ）。7、取出后观察是否充分匀浆，如未充分匀浆，继续置于匀浆机中匀浆。8、去除封口膜，再加入 Trizol：800l。（Trizol：200l + 800l = 1 ml）9、室温静置 10 min（15 30 ）。（二）细胞抽提1、倒掉培养基，PBS洗，直接将1 ml Trizol 注入培养瓶（5×10610×106），细胞刮子刮碎细胞。2、或转入冻存管中冻存或直接进入分相操作（第 10 步）。二、分相10、在装有裂解物的EP管中加入 200l 氯仿（为Trizol总体积的 1/5）。11、剧烈振荡 30 秒。12、冰上静置 10 min（关键）。13、离心

9、：12000 rpm×15 min，4 （离心机盖盖子）。 分相为三层 上层：RNA（约为Trizol的 60%）； 水相层中间：DNA；下层：蛋白质(酚-氯仿)。 有机相14、小心吸取上清液，转移至另一 EP 管中200l× 2次（或150l 170l × 3 次）。1ml裂解物产生的上清液体积约为 400l（或400l 600l）。有机相和中间层含有DNA和蛋白质，避免触及，宁少勿多。三、RNA沉淀15、加入与上清液等体积的异丙醇（约 400 l）。.16、颠倒混匀。17、室温下静置 10 min（20 30 ）。（开烤箱至60 ，为第 30 步做准备）18、

10、离心：12000 rpm×10 min，4 （离心机盖盖子）。19、小心弃去上清液（直接倒去上清液），避免振动RNA沉淀。（RNA沉淀在EP管底的侧面形成，乳白色）四、RNA清洗（清洗两次，去离子/盐）20、离心管加入1 ml 预冷的 75% 乙醇（1 mlTrizol至少加 1 ml乙醇清洗DNA）。21、弹起RNA，使沉淀振荡起来。22、室温 9500 rpm×5 min，4（离心机盖盖子）。23、小心弃去上清液（直接倒去上清液），避免振动RNA沉淀。24、离心管加入1 ml 预冷的 75% 乙醇（ 1 ml Trizol至少加 1 ml乙醇清洗DNA ）。25、弹起R

11、NA，使沉淀振荡起来。26、室温 9500 rpm×5 min，4（离心机盖盖子）。27、小心弃去上清液（直接倒去上清液），避免振动RNA沉淀。28、倒置于滤纸上，并用滤纸吸乙醇，放置 5 min（ 10 min，不可过干）。29、加适量DEPC水 50l（ 25l 200l ），保证RNA浓度 1g/l。30、温箱中60温育 5 min，混匀。31、拿出后置于冰上。（或置于80冰箱中）五、测RNA浓度和纯度取1l样本在光度计上测量。OD260 代表RNA的OD值，OD280 代表蛋白质的OD值。OD260/OD280： 1.8 蛋白质污染 1.82.0 理想范围 2.0 RNA降解

12、六、调整RNA浓度测得浓度（单位为：ng/l），加DEPC水调至相同浓度。取总RNA量为1000 ng（即1g），逆转录过程中去除基因组DNA时变为总体积10l。 1000ng/测得的浓度=应取RNA液的体积（保留至小数点后两位） 7lRNA液体积=应加水的体积（保留至小数点后两位）应取RNA液的体积、应加水的体积均加入PCR管中，用于逆转录RNA逆转录准备工作试剂及仪器逆转录试剂盒、PCR管、无RNA酶枪头。仪器处理及试剂配制注意事项操作步骤1、 基因组DNA的去除反应逆转录反应体系（20l）试 剂使用量 (l)5×g DNA Eraser buffer2lg DNA Eraser

13、1lTotal RNA7lTotal volume10.0反应条件42 2min（或者室温5 min）42、 反转录反应逆转录反应体系（20l）试 剂使用量 (l)5× primescript buffer 24.0Primescript RT Enzyme Mix 11.0RT Pimer mix1.0上一步的反应液10Rnase Free dH2O4.0Total volume20.0反应条件37 15min85 5s4 （或-20长期保存）普通PCR试剂及仪器与实时定量的试剂可以共用，但不需要ROX，将0.4 l换成水即可。步骤配胶：每一小块胶（1/4方格）需15 ml左右，浓

14、度1%3%均可（每15ml加琼脂粉0.15g0.45g），浓度越高，跑胶时间越长，相对较好。Loading Buffer:PCR产物=1:46，即每20l的PCR产物加4l左右Loading Buffer。每孔加样20l左右上述混合物。Maker加5l左右。胶孔对着负极（黑色）。设定电压100V，电流不管，时间35分钟左右，胶浓度高时，适当延长时间，40分钟左右。紫外观察按左起第2个按钮。胶回收准备工作试剂及仪器Axygen kit（buffer DE-A/B、buffer W1/W2、Eluent），准备60水浴，检查DE-B是否有沉淀，W2中加入无水乙醇。仪器处理及试剂配制注意事项1、 D

15、NA不可长期暴露于紫外下，防损伤。操作步骤1、 在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽表面液体并切碎，计算重量，论100 mg重量为一个凝胶体积（100 mg=100l体积）2、 加入3个凝胶体积的buffer DE-A液（300l），混合后68水浴，间断混合（2 min3 min），至凝胶溶化（6 min8 min），变为红色。3、 加入0.5个A体积的B液（150l），混合均匀，若分享DNA片段400bp时，加入一个凝胶体积的异丙醇（100l），变为黄色。（混匀）4、 吸取上述步骤3中的混合液，转移至DNA制备管（2 ml离心管）中，离心12000 rpm×1 mi

16、n（2 min）。充滤液。5、 加入500l W1，离心12000 g×30 s（2 min），弃滤液。6、 加入700l W2，离心12000 g×30 s（2 min），弃滤液。以同样的方法加700l W2洗涤，离心12000 g×30 s（2 min），弃滤液。7、 空转，离心：12000 g×1 min（2 min）。8、 将制备管置于1.5ml离心管中，加入25l 30l Eluent或去离子水，室温静置1 min，12000 g×1 min，洗脱DNA（水加热65）。 RT-PCR准备工作试剂及仪器RT-PCR试剂盒（SYBR GR

17、EEN、ROX）、DEPC水、引物（Forward Primer + Reverse Primer）、目标基因PCR胶回收产物、无RNA酶枪头（蓝、黄、白）、无RNA酶EP管（1.5 ml）、PCR管盒、PCR管、八联管、镊子、口罩、PE手套、小离心机（八联管用、EP管用）、旋涡机。注意事项1、SYBR GREEN和混MIX用的EP管，都需用锡泊纸避光。2、所有操作在冰上进行。3、引物定购回来时是干粉，一般按要求溶解至100M保存，使用时需稀释至10M。但-actin表达量很高，需稀释至1M使用。操作步骤一、稀释标准曲线1、 取出我的百宝箱。2、 准备冰块。3、 取出（共有大EP管×

18、7）DEPC水、目标基因PCR胶回收产物、RT-PCR试剂盒（SYBR GREEN、ROX）、引物（Forward Primer + Reverse Primer）、无RNA酶EP管一个（1.5 ml）以及试验样本放于冰上。4、 准备1012个PCR管，在PCR板上正向排好（从左到右）。5、 将板旋转180°，加 DEPC水18l 。6、 再将板旋转180° ，2l 胶回收产物于第1管，依次倍比稀释（加样、离心、弹匀、再离心、再弹匀、最后离心、取出2l至下一管，稀释好的PCR管放在另一排，从右向左排列，最终是从左到右依次低浓度到高浓度排列）。二、混MIX7、 按下表顺序混M

19、IX。实时定量PCR反应体系（20l）试剂使用量（l）终浓度H2OSYBR Premix Ex TaqTM6.810.01×ROX Reference Dye(50×)PCR Forward Primer (10 µM)0.40.41×0.2 µMPCR Reverse Primer (10 µM)0.40.2 µMDNA模板(cDNA溶液)2.0Total20.08、 旋涡混匀并离心（两次）。9、 准备八联管于槽内，并置于冰上。10、 将槽旋转180°放置，加MIX液18l。11、 再将槽旋转180°，

20、先加标准曲线，再加空白对照和样本。12、 戴PE手套。13、 取出八联管盖并盖紧。14、 标记。15、 离心。16、 放另一槽内再压紧。17、 上机。18、 打开程序，设置基本参数（2、1、2、1）、plate、RUN、文件名等。19、 按加样顺序设定孔标记。、20、 按加样顺序在在实验记录本上记录体系、反应条件、样本顺序、文件名等。反应条件95 预变性 30 sec95变性 5 sec退火温度 30 sec延伸温度 30 sec同步RNA提取蛋白1、 取上清后，加300l无水乙醇，混匀2、 室温放置3 min。3、 离心：4900 rpm×5 min，4。4、 上清至另一EP管中（

21、编号）。5、 加1.5 ml异丙醇，混匀。6、 室温放置10 min。7、 离心：12000 rpm×10 min，4。8、 弃上清。9、 加2 ml含0.3 mol盐酸胍的95%乙醇，洗沉淀。10、 室温放20 min。 ×311、 离心：9500 rpm×5 min，4。12、 弃上清重复上步三次13、 弃上清。14、 加2 ml盐酸胍（0.3 mol）15、 放置20 min。16、 离心：9500 rpm×5 min，4。17、 弃上清。18、 加2 ml无水乙醇。19、 放置20 min。20、 离心：9500 rpm×5 min，4

22、。21、 真空抽干蛋白，沉淀510 min。22、 1% SDS溶解。23、 反复吹打。24、 50温溶，使其完全溶解。25、 离心：1000 rpm×10 min，4。26、 取上清。27、 20保存。注意事项1、 每3050 mg组织加1 ml Trizol，保证体积不超过Trizol的10%。2、 每使用1 ml Trizol至少用1 ml 75%乙醇洗涤。3、 DEPC水：将纯水加入瓶中，加DEPC，浓度0.1%，放置过夜，高压。4、 75%乙醇，用DEPC水配制。5、 0.3 mol盐酸胍的95%乙醇：盐酸胍 0.286g 95%乙醇 10 ml.6、 1% SDS：SDS

23、 1g 双蒸水 100 ml蛋白提取试剂：Western 细胞裂解液（碧云天）、PMSF（蛋白酶抑制剂）、PBS、异丙醇、乙醇。用品：离心管、细胞刮、冰盒、EP管、滤纸、离心机（4）操作步骤1、 溶解细胞裂解液，混匀，分装，-20保存。2、 配0.1M PMSF：17.4 mg + 异丙醇：1 ml 分装至EP管，-20保存。3、 预冷PBS洗三次，置冰上。4、 裂解液：1 ml + PMSF：10ml 终浓度1 mM5、 加入含PMSF裂解液，匀浆裂解。6、 离心：12000 rpm×10 min，4。7、 上清移至EP管中，-20保存。蛋白浓度测定试剂：BCA蛋白测量试剂盒（普利

24、莱）用品：温箱、96孔板、酶标仪、冰盒操作步骤1、 冰上裂解样本，BCA标准品。2、 配工作液（WR） A + B=50:1。3、 稀释标准品，做标准曲线4、 样品或标准品：25ml + WR：200ml ，加入96孔板，混匀。5、 温箱内60×30 min（或20 min）6、 冷却至室温，酶标仪570 nm，OD测定（562 nm读数）。Western Blot配液Western Blot配液1、 10% 过硫酸铵 AP【0.5 g】 ddH2O【5 ml】 4 保存1周。2、 30% 丙烯酰胺一甲双丙烯酰胺（PH 7.0，温热利溶） 毒！Acr【29g】 Bis【1g】 ddH

25、2O 【100ml】 过滤，避光保存1个月3、 10% SDS SDS【10g】 ddH2O 【100ml】 5水溶，溶解充分，室温保存4、 TEMED 毒！ （神经毒性，临用时配制）5、 1.5 M Tris HCl（PH=8.8）Tris【18.15 g】 48 ml 1mol/HCl 水 【100ml】 4 过滤 Tris【12.12 g】 ddH2O 混HCl调PH至6.8 【100 ml】6、 1×电泳缓冲液（PH=8.3）25 mM Tris，0.25M甘氨酸，0.1%SDSTris【3.03g】 甘氨酸【18.77g】 SDS【1g】 加ddH2O定容至【1000 ml

26、】室温保存，可重复使用23次；可配10×贮存液7、 电转印缓冲液（PH=8.3）甘氨酸39mM，Tris 48 mM，SDS 0.037%，乙醇20%甘氨酸【2.9 g（14.4）】 Tris【5.8 g（3.03）】 SDS【0.37 g （0.5）】+ 甲醇【200 ml（200）】 加ddH2O定容至【1000 ml】8、 TBS（Tris 25 mM，NaCl 0.15 M） PH=7.6 4，N个月 Tris【3.0285g】 NaCl【8.766g】 加ddH2O定容至【1000 ml】9、 TBST（含0.05% Tween20 的TBS） TBS【500 ml】 Tw

27、een20【0.25 ml】 混匀10、 封闭液（含5% 脱脂奶粉 TBST） 奶粉【5 g】 TBST【100 ml】 4保存，使用时恢复至室温，一次性使用11、 丽春红染液 丽春红【0.5 g】 冰乙酸【1 ml】 H2O 【100 ml】 可重复使用12、 20% Tween 20 Tween20【10 ml】 H2O 【50 ml】 混匀，4保存13、 10% 甲醇 甲醇【3 ml】 H2O【30 ml】Western Blot步骤1、 清洗玻板：洗衣粉自来水10% PBS自来水无水乙醇（擦）自来水双蒸水晾干2、 玻板：检漏，滤纸吸干。3、 配12%分离胶。7.5 ml胶块：水2.45

28、 ml1.630% Acr-Bis3.0 ml2.01.5 Tris（PH8.8）1.9 ml1.310% SDS0.075 ml0.0510% AP0.075 ml0.05TEMED0.004 ml0.002 注：TEMED最后加，充分混匀，立即灌胶。4、 用枪吸胶，沿玻板放入。胶升到红 上缘即可。然后在胶上小心注入水（慢），赶走气泡。5、 30 min后水和胶之间有折线时，再等30 min使胶充分凝固，倒过上层水，并用滤纸吸干。6、 配25%分离胶（3 ml/胶）水2.1 ml30% Acr-Bis0.5ml1.0 Tris（PH6.8）0.38ml10% SDS0.03ml10% AP0

29、.03mlTEMED0.03ml7、 加胶后，赶快插上1.5 mm梳子，在浓缩胶凝固过程中要经常在两边补胶，30min后，竖直向上拔出梳子，取出胶条，吸干孔中的水。8、 将胶放入电泳槽（小玻板向内，大的向外，另一边加塑料板）。9、 加入电泳缓冲液，过内侧小玻板。10、 加样：1015l，60g。11、 电泳：恒压60V×1h（打开电泳仪，先将电压调0，电流调到最大，然后启动电泳仪，调电压至60V）12、 待样本进入二胶分界线时，调120V×2h。13、 溴酚兰跑至2/3分离胶时，停止电泳。14、 转膜：6张滤纸，2块海绵，1张NC膜（先在冰上泡30 min，作记号），泡入转

30、印缓冲液中泡30 min（PVSF膜先泡甲醇10 min，无光膜之分）15、 “三明治” 黑板（） 红板（）黑板（）海绵注：上下滤纸不得接触胶面滤纸胶大小膜面滤纸膜大小逐层赶走气泡滤纸胶NC膜（光面对着胶）滤纸红板（）海绵16、 切胶。17、 夹子放入转印槽中，4，恒流250mA，转印2小时。18、 NC膜蛋白朝上，剪去左下角，ddH2O中洗，10%甲醇浸泡1 min。于脱色摇床上，将膜用1×丽春红染5 min。ddH2O洗数次。19、 NC膜蛋白朝上，至封闭液中，2.5 h，吸干（37），120 rpm。20、 一抗以（脱脂奶粉）封闭液稀释，膜面朝下，37振2 h，80100 rp

31、m，4过夜。21、 回收一抗，4保存（一周），以TBST洗膜2次×10 min，TBS洗膜1次×10 min。22、 二抗以封闭液稀释，蛋白面朝下，37振1.5 h，80100 rpm。23、 洗膜同21。24、 DAB显色：2 ml蒸馏水2滴A混匀，再加2滴 B和C，再次混匀，将此液体滴加到膜表面，避光显色10 min，H2O终止反应。注意事项1、 SDS分离范围丙烯酰胺浓度（%）线性分离范围1512431016687.536945.0572122、 胶灌入玻璃板后不能移动。3、 分离胶中时间应尽量长，让溴酚兰刚跑出胶时为好。4、 夹“三明治”要在转印液中进行。5、 电泳

32、在冰上进行，以免损伤电泳槽。6、 丽春红染色时间不宜过长，以免不好脱色。7、 封闭液及洗膜时120140 rpm，抗体孵育80100 rpm。8、 DAB有致癌性，现配现用。Chip（染色质免疫共沉淀）第一天：1.交联染色质制备1) 将组织从-80冰箱中取出，在冰上解冻；2) 取50 mg肝脏于1.5 mL离心管（根据自己所要检测的修饰种类，提前计算好需要几份组织），用剪刀将组织切碎（或用匀浆器处理成组织块，我们实验中采用的条件是：组织:珠子:buffer=1:1:2，速度5，时间3 min）。然后转移到装有1 mL冰的 1×PBS的1.5 mL离心管中。3) 加入27 L 的37%

33、甲醛溶液（终浓度为1%）；室温孵育13 min；4) 用53 L甘氨酸（终浓度0.125 M）终止交联；室温孵育5 min，置于冰上；5) 4 2,000×g离心5 min，倒去液体；6) 用1mL冰的1× PBS清洗组织三次，每次弹起悬浮物后，4 2,000×g 离心5min；7) 在1 mL冰的1×PBS（含蛋白酶抑制剂：PMSF 1 mM、Leupeptin 10 g/ml、Pepstatin A 1 g/ml）中用匀浆器匀浆组织直至清亮；8) 4 2,000×g离心5 min，倒去液体。2 裂解细胞及超声染色质1) 加入0.5 mL L

34、ysis Buffer（含蛋白酶抑制剂,），温和地吸打，避免产生气泡；2) 冰上孵育5 min；3) 在EP管中超声破碎，超声破碎后溶液变清亮且无气泡；超声参数：2号探头，信号输出40%，总时间4min，作用2 s，暂停1 s；（超声条件需要预实验，预实验步骤如下）4) 4°C，15,000×g离心10 min。取上清。超声预实验：超声时设置不同的时间梯度，进行检测，看最适合的超声条件。超声后，用琼脂糖电泳检测：取200 L超声处理液，加8 L 5 M Nacl，65°C水浴4 h解交联；加入20 L Rnase A（10 mg/ml），于37水浴1 h；加入8

35、L蛋白酶K（20 mg/ml），于37水浴1 h；用2%的琼脂糖胶电泳检测。3 Protein G珠子的封闭1) 将浸泡于20% PBS的Protein G beads（PBS: beads=1: 1）轻弹重悬；2) 按40L/sample悬液加到1.5 ml离心管中，4°C，4,500×g 离心1 min，沉淀beads。去除含PBS的水相；3) 加1 ml含1 mg/mL BSA的 TE buffer，4°C，4,500×g 离心1 min，去上清；4) 重复离心两次；5) 最终重悬beads于一倍体积的Dilution buffer。4 染色质与抗

36、体、beads共孵育1) 于冰上，向超声处理液中加入2 mL的Dilution buffer；2) 取10 L稀释液作为“Input”，4保存；3) 每1 mL稀释液加入40 L封闭后的Protein G beads和抗体（8 3K4me33 0ffersg IgG, 5 3K4me33 0ffersg H3K4me3, 4 3K4me33 0ffersg H3K9me2, 5 3K4me33 0ffersg H3K27me3）；4) 在旋转摇床上，4孵育过夜。第二天：1 清洗免疫沉淀物1) 4°C，4,500×g离心1 min，吸除上清，收集beads；2) 加入1 mL Wash Buffer I，4,500×g 离心1 min，洗沉淀物；3) 用Wash Buffer II， Wash Buffer III， 两次TE重复离心；4) 在100 L的Elution buffer（含200 g/mL蛋白酶K）中轻弹重悬沉淀，室温孵育5 min；5) 4,500×g 离心1 min，收集上清到新的1.5 m