曲骨发育不全综合征示FGFR2在核糖体DNA转录中有细胞核活性

1、.曲骨发育不全综合征揭示FGFR2在核糖体DNA转录过程中有胞核活性成纤维细胞生长因子2（FGFR2）在骨发育期间促进骨祖细胞增殖和分化，而受体如何引出这些不同的细胞反应仍然不清楚。对FGFR2-骨骼障碍曲骨发育不全综合征（BBDS）的分析揭示出FGFR2除了其在细胞膜表面的经典信号活性外，还在细胞核内调控骨的形成。之前我们显示了一种独特的引起BBDS的FGFR2突变，这种突变减少了胞膜上的受体水平，并减少了其对胞外FGF2的反应性。在本研究中，我们发现这些突变不仅减少经典信号传递，还在核糖体DNA（rDNA）启动子上增强了FGFR2的细胞核占据。核FGFR2通过降低RUNX2的表达与FGF2

2、和UBF1发生相互作用，从而激活rDNA的转录。BBDS中FGFR2核活性的增高使得发育阶段骨中核糖体RNA水平升高，从而促进了骨祖细胞的增殖并降低了其分化。将FGFR2识别为骨中一种rDNA的转录调控因子，这令人意外地显示了FGF信号传递中的一种细胞核路线，这一路线使得FGF能独立地调控骨祖细胞的增殖与分化。INTRODUCTION骨骼发育中的先天缺陷影响着很大一部分人，每3000个成活初生儿中就有1个受累（1）。这些骨骼疾病很多是源自确定骨的大小和形状的那些基因在胚胎发育期间发生了突变。成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2）（MIM：176943）就是这类基因中的一个。那些增强了受体活性的

3、FGFR2突变，在Apert，Crouzon，Jackson-Weiss以及Pfeiffer综合征中引起颅骨和肢体骨内骨骼融合（2）。与之相比，那些降低了受体活性的FGFR2突变在Larimo-auriculo-dento-digital（LADD）综合征中引起颅骨和肢体骨内骨发育不良（3）。小鼠中的基因研究显示Fgfr2突变通过改变受体对骨祖细胞的调控，干扰了骨骼发育：Fgfr2功能增强，细胞的增殖与分化就增强（4，5），而Fgfr2功能减弱，增殖与分化就减弱（6，7）。当Fgfr2基因突变既促进骨骼发育阶段时期骨祖细胞增殖，也促进分化时，受体引出这种相矛盾的细胞反应的机制尚不清楚。有证据提

4、示在FGFR2上游或下游起作用的那些FGF信号传递组分的搭配，并不是以要么促进细胞增殖，要么促进细胞分化这样一种单一的形式相连的。举例来说，不同的FGF配体比如FGF2和FGF18，同时促进骨祖细胞的增殖与分化（8，9）。相似的是，在骨祖细胞中，FGFR2介导不同下游信号传递级联反应比如MAPK或PLC的活化，这同时促进了增殖和分化（1012）。FGFR2在骨祖细胞中的双重作用可以通过其在受体活化初始阶段时转录分布情况上的不同来解释。尽管如此，FGF信号引出原始转录反应的机制仍不清楚，这是因为该途径靶向的转录调控蛋白广泛表达，被多种信号传递途径利用（13）。但是有趣的是，FGF信号传递途径在细

5、胞核中直接出现。FGF2通过不同的转录过程产生五种同工型蛋白，它们全都含有细胞核局限化信号（NLS）（14）。小分子量FGF2一开始被分泌，然后在胞吞作用下转入核中，而高分子量同工型仍然留在细胞内，在合成调控增殖后移入细胞核内（15）。FGF2的NLS据显示也通过输入蛋白（importin-）促进FGFR1进入细胞核（16）。核FGFR1-FGF2共同局限化以激活核小点，这与转录活化有关（17）；但是，核FGFR1-FGF2利用的直接基因靶点尚不清楚。本研究中，我们对曲骨发育不全综合征（BBDS MIM614592）中独特的FGFR2突变进行了分析，显示出了核FGF信号途径的一个直接基因靶点，

6、并且同时解决了FGFR2在骨中的双重功能（18）。BBDS与其它FGFR2病变不同，在颅面骨和四肢骨中表现出骨化缺失，但其有骨祖细胞的充分支持（18）。这一表型提示本病中专有的FGFR2错义突变分开了FGFR2对骨祖细胞增殖和分化的双重作用。BBDS中显性FGFR2突变，p.Met391Arg或p.Tyr381Asp，位于其跨膜区，选择性地减少了FGFR2在膜上的水平，从而降低了受体对胞外FGFs的反应（18）。BBDS表型的某些方面似乎是由经典FGF2信号传递降低所致，但仍然有很强的证据本病不是由FGFR2某样功能的精确丧失所致：BBDS中的骨骼缺失与LADD综合征中的这种缺失，或是在成骨性

7、中胚层中条件性敲除Fgfr2的小鼠中的这种缺失不重叠（3，6）。这里，我们给出了有力的证据，即核FGFR2活性增强可以解释BBDS中骨骼缺失的病理生成过程。我们揭示了在骨祖细胞中核FGFR2在rDNA启动子处与FGF2和UBD相互作用，并限制了RUNX2造成的转录抑制，从而直接激活rDNA转录。此外，我们显示了BBDS中的FGFR2突变增强了核FGFR2活性，从而升高了rRNA水平，促进了骨祖细胞的增殖并降低了成骨细胞分化。通过将FGFR2识别为骨中rDNA的一种转录调控因子，我们的工作意外地显示了FGF信号传递的一条细胞核路线，该路线使得FGF信号可以独立地调控骨祖细胞的增殖与分化。RESU

8、LTSBBDS中FGFR2和FGF2在细胞核中局限化的情况有变化BBDS中的FGFR2突变增强了FGFR2与rDNA转录调控者在细胞核中的局限化FGFR2在细胞核中局限化的增强强化了ERK-MAPK通路的活化BBDS中的FGFR2突变通过增加rDNA转录促进了FGFR2的有丝分裂活性BBDS中的FGFR2突变使rDNA重复序列中UBF-1结合位点处的FGFR2增多BBDS中的FGFR2突变减少了成骨细胞分化FGFR2的核活性增加限制了RUNX2介导的rDNA转录抑制DISCUSSION通过研究BBDS的病理生理过程，我们揭示了FGFR2在骨祖细胞中的细胞核作用。我们显示了引起BBDS的FGFR

9、2突变增强了FGFR2在细胞核中的普通功能，在细胞核中FGFR2在rDNA启动子处与FGF2和UBF-1相互作用，通过限制RUNX2引起的转录抑制，促进了转录。其产物rRNA的增加在骨祖细胞中促进了增殖，减少了成骨细胞分化。之前关于功能获得和功能丧失的研究已经显示了Fgfr2既能促进骨祖细胞的增殖也能促进其分化，而我们的工作揭示了这些活动是有区别的，并且在FGFR2的亚细胞局限化水平上受到控制。两条FGFR2信号途径，一条在细胞膜上，一条在细胞核中，可以分隔开RUNX2的作用，以维持骨祖细胞在增殖与分化之间的适当平衡（Fig.7E）。经典FGFR2信号传递始于细胞膜，通过增高RUNX2在一个骨

10、特异性基因处的表达，稳定与转录活性，启动成骨细胞的分化（12，36，37）。在另一方面，我们显示了细胞核FGFR2信号传递通过对抗RUNX2对rDNA转录的抑制作用，促进了骨祖细胞的增殖。因此，我们提出BBDS是FGFR2经典信号传递和细胞核信号传递失衡所致。BBDS中致病性FGFR2突变是第一种揭示了核FGF信号传递在椎骨发育过程中作用的FGFR基因改变。核FGF信号传递的证据出现已有近20年了。但是，没有遗传学方法彻底描述过FGFRs在细胞核中的作用。人们已经观察到Fgfr2在椎骨发育过程中的分化阶段出现（39），但这一现象仍未大规模研究过，这是因为用于研究Fgfr2功能的小鼠模型，包括各

11、类敲除和敲入模型，含有各种遗传改变，使人们无法将受体的细胞核功能和细胞膜功能区分开来。我们发现BBDS中促进rDNA转录的核FGFR2参与了其它先天性疾病。FGFR2突变与至少10种不同的出生缺陷有关，检测在这些疾病中FGFR2的细胞核活性上的变化是否参与形成了骨骼上的异常，这十分重要。我们预期由FGFR2功能获得性突变引起的骨祖细胞增殖与分化的增加，可以由细胞膜和细胞核中FGFR2信号传递增多来解释。反过来，我们预测由FGFR2功能丧失造成的骨祖细胞增殖与分化减少，可以由细胞膜上和细胞核中FGFR2信号传递都减少来解释。我们的发现也将为一类伴有核糖体功能异常的出生缺陷，即所谓的核糖体病点亮希

12、望。核糖体是细胞的一个蛋白质生产中心，在mRNA翻译中起着独特而不可或缺的作用。但是令人意外的是，伴有核糖体功能异常的人类疾病，包括Treacher Collins综合征和Diamond Blackfan贫血，表现出与BBDS类似的特定骨骼缺陷（40）。我们关于FGFR2在成骨细胞前体中调控rDNA转录的发现，识别出了骨骼发育过程中，核糖体生物合成的上游调控过程中的一种新特征，可以解释这种表型上的重叠。对FGFR2在rDNA转录中起到的一种作用的定义，也为癌症的病理过程与治疗方案带来了新的理解。在骨骼出生缺陷中发现的许多FGFR2种系突变，与癌症中体细胞的FGFR2突变完全一样。子宫内膜癌，乳

13、腺癌，肺癌，胃肠道肿瘤，以及肾癌都带有FGFR2活化突变，这些突变在颅缝早闭障碍中可见，包括BBDS中的p.Met391Arg（41）。种系和体细胞遗传上的这种融合强烈提示它们有共同的病因。FGFR2调控rDNA转录的能力可能是其分子连结，因为增高的rDNA转录诱导了肿瘤的变化（42）。目前，非特异性靶向FGFRs抑制剂被用于临床以治疗癌症，而由于FGFR2既起原癌作用，也起抑制剂作用，也许可以证明目前这种方法是有问题的（43）。我们关于FGFR2有两种不同信号传递途径的发现可能帮助开发更为安全的癌症治疗方法，这种方法特异性针对FGFR2在细胞核中的增殖前作用，同时避免与非选择性FGFR抑制剂相关的那些潜在危险副作用。通过显示核FGFR2信号传递在人类发育过程中的生物学意义，我们在BBDS中的发现帮助扩展了对FGF信号传递的思维模式。大部分信号传递途径通过通路特异性转录因子来引导基因表达，从而调控发育：TGF信号途径依赖Smads，Wnt信号传递利用TCF/LEF，而Hedgehog途径利用Gli。目前还没有发现哪个转录因子参与FGF途径，我们的研究显示这条途径可以通过利用核F