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文档简介

1、阿维菌素的发酵一、实验目的学习阿维菌素的发酵过程二、实验原理阿维菌素的发酵共分三大工序：菌种、发酵、提取。配合三个工序进行分析化验和有关产物测定。衡量抗生素发酵液中抗菌物质的含量称效价。抗生素效价测定可采用化学法或生物效价测定法。本实验采用高效液相色谱法测定抗生素的效价。三、实验材料1. 菌株阿维菌素链霉菌斜面菌种。2. 培养基培养阿维菌素链霉菌所用的斜面培养基、分离培养基、种子培养基、发酵培养基。见附录出。3. 仪器及药品接种环，培养皿，三角瓶，摇床，离心管，高效液相色谱柱，漩涡振荡器，微孔滤膜，淀粉酶，丙酮，乙酸乙酯，无菌水。四、实验方法1. 实验用菌种的制备（ 1）单孢子悬液的制备向阿维

2、菌素链霉菌抱子斜面中加入10mL无菌水，用接种环刮取抱子，震荡打碎，过滤得到单孢子悬液。（ 2）自然分离将得到的单抱子悬液稀释，分别涂布于含有分离培养基的平皿中，在28c条件下培养79天。2. 发酵培养基和待检测发酵液样品的制备（ 1）水解淀粉的制备称取玉米淀粉200g，先加入少量水混合均匀，加热使其糊化，降温至60，然后在糊化的淀粉液中加入的淀粉酶，恒温搅拌10min，最后加热至沸腾状态，保温5min，使残留的淀粉酶失活，降温待用。（ 2）液体发酵铲取面积为Xcm2大小的斜面培养物，将其接种至种子瓶的培养基中，28c摇床培养22h后，按发酵摇瓶装料体积的5%接种至发酵瓶中，28培养9天。（3

3、）检测发酵液中阿维菌素样品的制备取5mL摇瓶发酵液于离心管中，3000r/m离心10min,弃去上清夜。在发酵液的沉淀物（菌丝体）中加入2mL丙酮，在漩涡式混合器上震荡1min,静置10min,如此重复3次。然后加入3mL乙酸乙酯，震荡1min,静置10min,3000r/m离心10min,最后小心地吸取其中的上清夜作为样品，待检测。3. 阿维菌素含量的测定利用高效液相色谱法（HPLC检测（1）HPLC条件色谱柱：KromasilC185科m200x流动相：CH2OH：H2O88：12（V/V）流速：min检测波长：244nm（2）标准曲线的测定配制一系列不同浓度的阿维菌素B1标准溶液（5003000科g/mL）,分别取各浓度标准溶液的过滤液5dL注入高效液相色谱仪中，测定其吸U犯峰值面积，然后对浓度（Y）和吸收峰面积（X）进行一元线性回归，得到一元线性回归方程。（3）效价的计算方法将乙酸乙酯萃取所得的上清夜用科m的微孔滤膜过滤，准确吸取滤液5“注入HPLC中，记录色普图，将B1峰面积代入上述的回归方程中，计算得到发酵液中B1组分发酵单位（科g/mL）。4. 发酵液中菌体浓度的计算取体积为V1（mL）的发酵液，3000r/m离心10min后，得到上清夜的体积计量为

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