CO2气腹对大鼠腹膜炎细菌生长及移位的影响

1、coa腹对大鼠腹膜炎细菌生长及移位的影响欧梦川1，罗云1，王崇树1,21.川北医学院附属医院普外一科（四川南充文化路63号637000）；2.川北医学院肝胆胰肠研究所（四川南充涪江路234号637000）摘要目的研究不同气腹压力及作用时间对大鼠腹膜炎腹腔感染细菌的生长繁殖和细菌移位的影响。方法大鼠腹腔内注射大肠杆菌标准混悬液，建立大鼠急性细菌性腹膜炎模型，60只SD大鼠随机分为6组，通过不同二氧化碳气腹压力及时间处理后，分别取腹水进行细菌定量培养和菌种分离鉴定，对门静脉血进行血培养和内毒素测定。结果经过气腹处理3小时后，高气腹组与对照组，低气腹组与对照组相比，细菌CFU&度有显著性升高

2、（P<0.05）;高气腹组血培养阳性率高于对照组（P<0.05）;高气腹组内毒素含量高于低气腹组（P<0.05）,低气腹组内毒素含量高于对照组（P<0.05）;腹水及血培养中都培养出了肠道常见定植需氧及厌氧细菌。结论二氧化碳气腹促进了腹膜炎大鼠的肠道内毒素和细菌移位，并且随压力和时间的增加而升高。二氧化碳气腹环境促进了腹水细菌的生长，以厌氧细菌的增加为主，总的细菌数量比无气腹的环境明显增加。腹腔镜手术目前正在全球范围内迅速普及，从最初的胆囊切除术逐渐扩展至其他学科领域，其中包括了很多感染性疾病在内，如化脓性阑尾炎、急性胆囊炎、重症急性胆管炎、结核性腹膜炎、胃肠道穿孔等。

3、相比开放性手术，腹腔镜手术具有创伤小、全身反应轻、恢复快、美容等优势。二氧化碳是目前较常用的创建气腹的气体，其对机体各个系统以及炎症反应影响的研究也较多，但对腹膜炎的影响并没有达成一致的共识。腹腔镜手术的微创性，能更好的保护机体的全身免疫系统，减轻全身的炎症反应，但同时，二氧化碳气腹也会导致局部腹膜免疫功能的抑制1。有不少实验也验证了二氧化碳气腹增加了菌血症的发生几率2，但同时也在动物实验中观察到，相比开放性手术，气腹组在腹腔感染模型中显著延长了大鼠的生存率3。临床资料研究也对气腹使腹腔感染扩散的推论予以否定，许多感染性疾病也通过腹腔镜手术得到了很好的治疗，并没有见到这些感染性疾病出现感染加重

4、或并发症的情况4。本实验，将在大鼠腹膜炎模型的基础上，通过形成不同时间及不同压力的coa腹，研究气腹压力对腹膜炎细菌的生长繁殖和移位的影响，确定是否二氧化碳气腹增加了败血症的发生几率。材料与方法1、 实验动物实验动物采用SD大鼠（由川北医学院实验动物中心提供），雌雄不限，体重范围在200-250之间。2、 主要试剂及器材Stryker全自动气腹机（川北医学院附属医院提供），梅里埃VITEK2全自动细菌鉴定仪，庞通公司处购入哥伦比亚血琼脂平板和麦康凯培养平板，金山川公司提供MB80散生物动态检测系统和革兰阴性菌脂多糖检测试剂盒。3、 建立急性腹膜炎模型将大鼠禁食禁水12小时，将大鼠上腹部处备皮，

5、碘伏消毒皮肤，以1%戊巴比妥钠30ml/kg腹腔注射麻醉动物，麻醉成功后将大鼠平卧固定在木板上，再分别用腹腔注射法接种1ml的ATCC25922s准大肠杆菌悬液（108CFU/ml）,建立腹膜炎大鼠模型。实验方法将SD大鼠随机分为六组，实验组15mmhg60min,5mmhg60min,15mmhg180min,5mmhg180min,对照60min组，对照180min组。对照组不经过气腹处理。实验组用空针针头于大鼠下腹部穿刺，连接软质塑料管和Stryker气腹机，按照不同要求设定压力、流速档位。五、标本的采集按照设定的时间气腹处理后，分别用实验组和对照组的大鼠进行剖腹处理，在无菌条件下取腹水

6、、门静脉血液各自标号待检，对其分别进行需氧和厌氧细菌的定量培养和菌种鉴定。再对抽取的门静脉血进行内毒素测定。六、观测指标1 腹水细菌CFL#数采取倍比稀释平板菌落计数法，取各浓度100ul接种于麦康凯琼脂平板上，分别做需氧和厌氧的细菌培养，厌氧细菌的培养是将培养基放入厌氧袋中置入孵箱培养，每个浓度做3个平板，对需氧和厌氧培养平板的细菌菌落进行计数。计算公式细菌含量（cfu/ml）=（需氧+厌氧）菌落数*稀释度/体积2 血培养细菌阳性率处死动物后打开腹腔，取门静脉血0.5ml,用一定量无菌生理盐水稀释，分别取100ul接种在血平板上进行需氧和厌氧培养，有肉眼可见细菌菌落生长则为阳性，如果平板培养

7、3天以后仍没有细菌生长，则为阴性。3 内毒素的测定按照革兰阴性菌脂多糖检测试剂盒说明书进行操作，采用微生物快速动态监测系统中进行检测，反应结束后自动计算出待测血浆中内毒素含量。七、统计分析计量资料都以均数土标准差(世SDD表示，采用单因素方差分析和t检验,计数资料采用卡方检验，所有统计数据都采用SPSS13.0软件完成数据分析。结果1腹水细菌CFUS养不同压力及气腹作用时间下对腹水进彳T细菌定量培养，具细菌浓度用CFU8示，如表1,表1不同压力及气腹作用时间下腹水细菌CFW数(105cfu/ml)时间气腹压力60min180min高气腹组15mmhg5.39±0.966.94

8、7;0.49低气腹组5mmhg4.91±0.876.45±1.05对照组4.62±0.535.55±0.96气腹3小时后各组之间的腹水细菌CFU/ml的含量有显著性差异，P<0.05,进一步进行两两比较，低气腹组和高气腹组细菌含量没有差异，P>0.05,而高气腹组与对照组，低气腹组与对照组相比有显著性差异，P<0.05。对照组两个时间点的腹水细菌浓度，按a=0.05检验水准，P<0.05,1h和3h两个对照组之间有显著性差异，说明大鼠诱发急性化学性腹膜炎后3h腹水细菌的浓度呈进行性增高。说明在15mmh4口5mmhgl氧化碳气腹处

9、理3h后，细菌在腹腔的定植量有显著增高，但气腹压力的增高并没有使细菌的浓度有差异性的增高。2血培养结果各组动物血培养结果见表2,各组都发生了细菌移位。对照组中，1h和3h组之间的血培养阳性率无显著性差异（P>0.05）,故认为各组时间的不同对血培养的阳性率的影响并无差异，所以将1h和3h组合并，分为高气腹组、低气腹组和对照组。高气腹组血培养阳性率高于对照组（P<0.05）,气腹组血培养阳性率与对照组和高气腹组相比差异没有统计学意义（P>0.05）。表2不同压力及时间血培养阳性结果（单位：例数）时间气腹压力60min180min高气腹组15mmhg56低气腹组5mmhg34对照

10、组123门静脉内毒素含量的结果不同压力及气腹作用时间下门静脉内毒素含量见表3,对照组各时点股静脉血内毒素含量的t检验结果P<0.05,对照组各时点门静脉血内毒素含量有显著性差异，其门静脉血内毒素含量随着感染时间的增加呈进行性升高。表3不同实验组及对照组门静脉内毒素含量（pg/ml）时间气腹压力60min180min高气腹组15mmhg73.65±5.6092.93±6.48低气腹组5mmhg68.77±4.1388.13±4.55对照组64.40±4.8381.98±3.89气腹1小时各组门静脉血内毒素含量的方差分析，按a=0.

11、05检验水准，可以认为三组大鼠股静脉血的内毒素含量有显著性差别；进一步两两比较，可以认为高气腹组和低气腹组、高气腹组和对照组之间门静脉血内毒素含量有差异，且高气腹组内毒素含量高于低气腹组和对照组，而对照组与低气腹组之间静脉血内毒素含量没有差异（P>0.05）。气腹3小时各组间门静脉血内毒素含量的方差分析与1小时类似，可以认为三组之间门静脉血内毒素含量都有差别（P<0.05）,且高气腹组内毒素含量高于低气腹组，低气腹组内毒素含量高于对照组（P<0.05）。讨论肠道是人体最大的细菌及内毒素贮存库，其中定植了很多致病菌与益生菌，但在正常情况下机体并没有感染致病菌，这主要是依赖于完整

12、的肠道粘膜屏障功能。正常人体肠道粘膜屏障是由正常肠道菌群、免疫屏障和机械屏障构成的，任一部分的异常都能造成肠道通透性的增加，继而发生肠道细菌和内毒素移位5,6。二氧化碳气腹造成肠道细菌移位及菌血症的具体机制尚在研究中，一定压力的气腹可能造成了肠道机械屏障的破坏，从而促进了细菌的移位7。完整的肠上皮粘膜细胞和紧密连接是构成肠道机械屏障的重要组成部分8。肠道局部的良好血液灌注及供氧是维持正常肠粘膜上皮细胞功能的重要因素。Menconi等9研究发现酸中毒环境时，肠粘膜上皮细胞细胞膜结构受损，细胞问紧密连接变得松散，细胞代谢发生障碍，导致细胞跨膜路径和细胞通道同时增加，肠粘膜通透性增高，并且与酸中毒程

13、度呈正相关。程君涛等10指出腹内压增高可引起的小肠血流量显著降低，黏膜上皮细胞发生急性缺血缺氧而导致其结果和功能的改变，损害的程度也与压力的大小及作用时间有关。而赵晓琴11等也证明了腹内压增高时，会造成小肠上皮细胞显著损害和细胞间紧密连接(tightjunction)的疏松，导致肠粘膜通透性增高。肠道的细菌和内毒素更容易进入血液和淋巴，造成远处器官细菌的播散。大鼠腹膜炎本身就会导致肠道细菌的移位，这可能与炎症反应造成的肠粘膜屏障功能损害有关，且移位的细菌以厌氧菌为主12。二氧化碳气腹促进了腹膜炎大鼠的肠道内毒素和细菌移位，并且随压力和时间的增加而升高。即使在低压气腹状态下，长时间的作用也能够促进腹膜炎大鼠内毒素的移位。由于实验大鼠最初通过腹腔注射大肠杆菌混悬液造成了急性细菌性腹膜炎，腹腔内并无其它细菌感染，可知腹水培养出的细菌主要是由肠道细菌移位而来。大肠杆菌和各种致病菌在合适的培养条件下