升降散治疗急性肺损伤作用的实验研究

1、    升降散治疗急性肺损伤作用的实验研究作者：常加松 ,魏凯峰, 潘云    作者单位：南京中医药大学基础医学院，江苏南京210029【摘要】  【目的】探讨升降散治疗急性肺损伤的作用机理。【方法】40只雄性SD大鼠，随机分为正常组、模型组、升降散组（剂量为2g/kg)。给药6d后，舌下静脉注射脂多糖（LPS）复制急性肺损伤模型，取肺组织切片，免疫组化检测;采集图像，分析微血管内皮细胞核的平均灰度。【结果】升降散组与模型组比较，能显著性抑制微血管内皮细胞核中核因子B（NFB）的表达（）。【结论】升降散可通过抑制肺

2、微血管内皮细胞NFB的表达，抑制炎症反应对肺组织造成的急性损伤，对急性肺损伤起到防治作用。【关键词】  升降散/药理学；急性肺损伤/中药疗法;肺组织/病理学;疾病模型，动物;大鼠    核因子B（NFB）是重要的转录调节因子，参与多种炎症介质基因的转录与表达，参与了急性肺损伤的发生发展全过程，调控NFB的药物有可能成为治疗急性肺损伤的重要手段之一1。本实验通过观察在急性肺损伤后肺微血管内皮细胞中NFB的表达及升降散对其表达的影响，以探讨升降散对急性肺损伤的治疗作用机理。现报道如下。1材料与方法    11动物及分组雄性SD大

3、鼠40只，体质量（160±20）g，购于南京中医药大学实验动物中心，合格证号为syxk(苏)20020123，清洁级。所有大鼠随机分为3组：正常组、模型组、升降散组。    12药物升降散由僵蚕、蝉蜕、大黄、姜黄按质量比63121比例组成。将上药在粉碎机上分别粉碎后，过200目细筛，置干燥处备用。    13试剂及仪器NFB p65兔抗人、大鼠、小鼠抗体，即用型链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物（SABC）试剂盒（一抗稀释：1100），二氨基联苯胺（DAB）显色剂均购自武汉博士德公司;脂多糖（LPS）购自Sigma公司；其他试

4、剂为进口或国产分析纯。Olympus DP70 CCD图像获取系统；北航病理图像分析系统。    14给药与造模1升降散组灌胃剂量为2g/kg，浓度为50g/L，每天灌胃2次，两次间隔时间为4h，连续灌胃6d，正常组及模型组灌服等容积的蒸馏水。末次灌胃1h后，用20g/L戊巴比妥钠(40/kg)腹腔注射麻醉动物。正常组舌下静脉注射生理盐水2mL/kg。模型组及升降散组舌下静脉注射LPS（用生理盐水配制，浓度为25mg/mL，剂量为5mg/kg）复制急性肺损伤模型。各组于注射2h后采集标本。    15取材及切片各组于注射2h后，完整取

5、出左、右肺，取右下肺叶浸泡于40g/L多聚甲醛中固定，1周后常规石蜡包埋，切片，片厚5m，置56温箱中烤12h。    16免疫组化检测切片脱蜡至水，置于体积分数3%H2O2中，室温7min，消除内源性酶；pH 60枸椽酸盐缓冲液高压修复抗原，以下步骤按照试剂盒中说明书操作。    17图像观察及分析每只大鼠选1张结构完整的切片，在40倍显微镜下观察，每张切片随机选58支肺微血管，每支肺微血管镜下取46个内皮细胞，采集图像后用北航病理图像分析系统，分析内皮细胞核的平均灰度。    18统计学方法对所获取图

6、像的平均灰度及平均光密度值，用SPSS 110软件行单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett T3检验。    2结果    21升降散对急性肺损伤大鼠肺组织微血管内皮细胞NFB表达的影响结果见表1、图1。表1各组急性肺损伤大鼠肺微血管内皮细胞NFB表达组别ND正常组13105843±13649模型组1352451±9909升降散组1481512±106761，与正常组比较；1，与模型组比较表1结果显示，平均灰度的数值由低到高分别为模型组、升降散组、正常组，平均灰度的数值越低内皮细胞NFB表达越显著

7、。模型组与正常组比较差异有显著性意义（1），升降散组与模型组比较差异有显著性意义（1)。图1结果显示，正常组肺微血管内皮细胞NFB表达染色后，胞核呈淡蓝色；模型组肺微血管内皮细胞NFB表达染色后，胞核呈棕褐色；升降散组肺微血管内皮细胞NFB表达染色后，胞核呈棕色。肺微血管内皮细胞NFB表达越显著，染色越深，未表达胞核染色后呈蓝色。    3讨论急性肺损伤的发病机理主要是致病因子对肺血管内皮细胞的直接损伤和全身的炎症反应。全身炎症反应主要涉及到中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞和肿瘤坏死因子，白介素1、 8等炎症介质，以及它们与血管内皮细胞的相互作用, NFB的活化有调

8、节细胞凋亡的作用，能够抑制中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等炎性细胞的凋亡，导致炎性细胞的数量异常增多，释放大量的炎性介质。而抑制内皮细胞NFB的表达有减轻或治疗急性肺损伤的作用。升降散出于清代杨栗山伤寒温疫条辨，主要由僵蚕、蝉衣、姜黄、大黄组成，是治疗瘟疫火毒内郁三焦，气机不畅等病证的主要方剂，具有升清降浊、宣郁清热等功效。现代临床及实验研究发现，本方具有较好地退热、抗炎以及保护肺组织作用3-5。本实验结果表明，升降散治疗组可以显著性抑制造模后大鼠肺微血管内皮细胞NFB表达，结果与模型组比较有显著性差异（1）。升降散对急性肺损伤的治疗作用可能是通过抑制肺微血管内皮细胞NFB的表达，从而抑制炎症

9、反应的放大，对抗细胞凋亡，起到组织保护的目的。【参考文献】1Duffey D C，Chen Z, Dong G, et al. Expression of a dominant negative mutant inhibitorkappa B of nuclear factorkappa B in human head and neck syuamous cell carcinoma inhibits survival proinflammatory, cytokine expression and tumor growth in vivoJ. Cancer Res, 1999, 59 (14):3468.2谢蓉，董文核因子B的活化及其在急性肺损伤中的作用机制J福建医药杂志，2004，26（1）：112.3刘建军