细胞生物学课件14级第十四章

1、第十四章 细胞工程 细胞工程（细胞工程（cell engineering）:也称细胞技术。指也称细胞技术。指在细胞水平上，采用细胞生物学、发育生物学、遗在细胞水平上，采用细胞生物学、发育生物学、遗传学及分子生物学等学科的理论与方法，按照人们传学及分子生物学等学科的理论与方法，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得具有产业化的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得具有产业化价值的细胞相关产品的一门综合技术体系价值的细胞相关产品的一门综合技术体系. 广义细胞工程广义细胞工程微生物细胞工程微生物细胞工程植物细胞工程植物细胞工程动物细胞工程动物细胞工程第一节 主要相关技术基因操作基因操作细胞的遗传修饰细

2、胞的遗传修饰细胞的表型分析细胞的表型分析工程化细胞的应用工程化细胞的应用1）微载体（）微载体（microcarrier） 基质材料：交联葡聚糖基质材料：交联葡聚糖 1g 交联葡聚糖提供交联葡聚糖提供 6000cm2 附着面积附着面积l 微载体是大规模培养方法中最有使用价值的支持物。微载体是大规模培养方法中最有使用价值的支持物。一、一、 动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术( (一一) )基本策略基本策略1.1.增加培养容积增加培养容积2.2.增加细胞的附着面积增加细胞的附着面积2）中空纤维（）中空纤维（hollow fiber） 管壁半透性，细胞附于管外壁，管内可供培养液管壁半透性，细

3、胞附于管外壁，管内可供培养液通过。通过。l 有利于分泌型表达蛋白的纯化，但不易放大培养。有利于分泌型表达蛋白的纯化，但不易放大培养。3）微胶囊（）微胶囊（microcapsule） 半透性膜囊，细胞长于内壁。微囊颗粒需要自行半透性膜囊，细胞长于内壁。微囊颗粒需要自行制备，无商业购买途径。制备，无商业购买途径。l 细胞密度大、产物在单位体积中浓度高、分离纯细胞密度大、产物在单位体积中浓度高、分离纯化简单。化简单。3 3、抑制细胞的凋亡、抑制细胞的凋亡 在生产特定蛋白质（如疫苗、抗体等）的大规模细胞培在生产特定蛋白质（如疫苗、抗体等）的大规模细胞培养中宜用无血清培养：养中宜用无血清培养：p 避免血

4、清中的蛋白质对目的蛋白纯化的影响。避免血清中的蛋白质对目的蛋白纯化的影响。p 延长延长G1期或促使细胞停于期或促使细胞停于G0期，使细胞较长时间维持期，使细胞较长时间维持在高密度状态，利于产生更多目的产物。在高密度状态，利于产生更多目的产物。p 降低细胞死亡率，避免死亡细胞的蛋白酶释放至培养降低细胞死亡率，避免死亡细胞的蛋白酶释放至培养基导致目的蛋白降解。基导致目的蛋白降解。4 4、无血清培养：、无血清培养： 延长延长G1期，或促使细胞停于期，或促使细胞停于G0期，细胞活力正期，细胞活力正常，可有效抑制凋亡。常，可有效抑制凋亡。（二）基本培养系统（二）基本培养系统 传统悬浮培养系统：不锈钢发酵

5、罐（高度：直径传统悬浮培养系统：不锈钢发酵罐（高度：直径=1：1 3：1）和搅拌器，产生气泡易引起机械）和搅拌器，产生气泡易引起机械损伤。损伤。 旋转细胞培养系统：模拟失重状态，有效降低机旋转细胞培养系统：模拟失重状态，有效降低机械损伤，应用面广。械损伤，应用面广。1. 悬浮培养系统悬浮培养系统2. 气流驱动培养系统气流驱动培养系统 主要优势在于简化设计，因为不需要搅拌器中的主要优势在于简化设计，因为不需要搅拌器中的发动机和搅拌装置。发动机和搅拌装置。3. 微载体培养系统微载体培养系统：微载体与搅拌悬浮培养相结合的：微载体与搅拌悬浮培养相结合的培养系统。培养系统。4. 灌注培养系统灌注培养系统

6、：能自动地将：能自动地将“旧旧”的培养液排除，的培养液排除，同时自动地将新的培养液以相同速率补入到细胞生长同时自动地将新的培养液以相同速率补入到细胞生长的容器中。的容器中。 细胞的基本生长特征：细胞的基本生长特征：（三）影响大规模细胞生长的因素：（三）影响大规模细胞生长的因素：潜伏期潜伏期对数生长期对数生长期平台期平台期 优化大规模细胞培养的营养量化评估指标：优化大规模细胞培养的营养量化评估指标：1）考虑细胞密度、生存能力、有丝分裂指数、一）考虑细胞密度、生存能力、有丝分裂指数、一般形态及破碎数量的信息；般形态及破碎数量的信息；2）采用检测生化指标来判断。）采用检测生化指标来判断。 葡萄糖和乳

7、酸盐的浓度可以反映培养液的质量葡萄糖和乳酸盐的浓度可以反映培养液的质量情况；乳酸脱氢酶可以判断细胞损伤或破碎情情况；乳酸脱氢酶可以判断细胞损伤或破碎情况。况。 利用显微注射装置，将一个细胞的核移植入另一利用显微注射装置，将一个细胞的核移植入另一个去核细胞中，已得到重组细胞。是克隆的关键个去核细胞中，已得到重组细胞。是克隆的关键技术。技术。二、二、 细胞核移植（细胞核移植（nuclear transfer）（一）技术路线（一）技术路线1. 细胞质的选择：细胞质的选择： 受精卵、处于受精卵、处于M II期的卵母细胞，可以使植入细胞期的卵母细胞，可以使植入细胞核的基因组行为发生重编程（核的基因组行为

8、发生重编程（regrogramming），），从而去分化恢复全能性状态。从而去分化恢复全能性状态。2. 供核细胞的选择供核细胞的选择： 胚胎细胞、未分化的原始生殖细胞、胚胎干细胞、胚胎细胞、未分化的原始生殖细胞、胚胎干细胞、胎儿体细胞、成体体细胞。胎儿体细胞、成体体细胞。 分化程度分化程度 ，克隆效率，克隆效率 。3. 去核：去核：（1）紫外线照射去核）紫外线照射去核 通过破坏通过破坏DNA去核。损伤较大，基本弃用。去核。损伤较大，基本弃用。（2）盲吸法去核）盲吸法去核 依据依据M II期卵母细胞中第一极体与细胞核的期卵母细胞中第一极体与细胞核的对位关系，用去核针吸去第一极体及其附近胞质，对位

9、关系，用去核针吸去第一极体及其附近胞质，成功率约成功率约80%。（3）蔗糖高渗处理去核法）蔗糖高渗处理去核法 先经高渗蔗糖（先经高渗蔗糖（0.30.9mol/L）处理，使核）处理，使核微凸，以去核针去除。微凸，以去核针去除。（4）透明带打孔去核法）透明带打孔去核法 先以显微针在透明带打孔，以细胞松弛素处先以显微针在透明带打孔，以细胞松弛素处理后去核，提高卵母细胞存活率。理后去核，提高卵母细胞存活率。（5）超速离心法）超速离心法4. 重构胚的构建：重构胚的构建： 直接将供核细胞移植到直接将供核细胞移植到 M II期卵母细胞期卵母细胞/受精卵透明带下受精卵透明带下，经细胞融合实现重组，经细胞融合实

10、现重组已已应用于多种家畜。应用于多种家畜。 取供核细胞核直接注入已去取供核细胞核直接注入已去核的受体细胞质核的受体细胞质多用于克多用于克隆小鼠。隆小鼠。5. 重构胚的激活重构胚的激活（1）化学激活）化学激活（2）电激活）电激活p 处理后能够卵裂则表明激活成功。处理后能够卵裂则表明激活成功。6. 重构胚的培养与移植重构胚的培养与移植培养发育至囊胚或桑葚胚期后，方移植入子宫。培养发育至囊胚或桑葚胚期后，方移植入子宫。（二）不同供核细胞的核移植（二）不同供核细胞的核移植1. 胚胎细胞核移植：胚胎细胞核移植：童第周（童第周（1902-1979） 中国的中国的“克隆先驱克隆先驱”Megan &

11、Morag from English目前核移植已成功：两栖类、鱼类、昆虫、哺乳动物目前核移植已成功：两栖类、鱼类、昆虫、哺乳动物目前核移植未成功：爬行类、鸟类目前核移植未成功：爬行类、鸟类2. 体细胞核移植：体细胞核移植：1962，非洲爪蟾，非洲爪蟾Dolly，1997，Roslin Institute 体细胞核移植的成功，证明高度分化的成体细胞体细胞核移植的成功，证明高度分化的成体细胞核仍具发育全能性，能在成熟卵母细胞中实现重核仍具发育全能性，能在成熟卵母细胞中实现重编程，发育为完整个体。编程，发育为完整个体。 M II 期的卵母细胞中含大量期的卵母细胞中含大量MPF，可诱导供体核，可诱导供

12、体核发生一系列早熟变化，尤其易使发生一系列早熟变化，尤其易使S期细胞核出现期细胞核出现染色体异常，对染色体异常，对G1期染色体损害较小。期染色体损害较小。 选取选取G0或或G1期细胞为核供体，选期细胞为核供体，选MPF水平低时水平低时的卵母细胞为受体。的卵母细胞为受体。三、三、 基因转移基因转移目的基因需通过特目的基因需通过特定载体（如质粒、定载体（如质粒、病毒载体等）携带病毒载体等）携带进入细胞。进入细胞。（1）电穿孔法）电穿孔法：以脉冲电场使细胞膜产生细小空：以脉冲电场使细胞膜产生细小空洞，使外源洞，使外源DNA进入细胞质。进入细胞质。（2）显微注射法）显微注射法：将：将DNA直接注入细胞

13、，多用于直接注入细胞，多用于制备转基因动物。制备转基因动物。 优点优点：不含病毒基因组片段：不含病毒基因组片段 缺点缺点：基因随机整合于染色体，易导致受体细胞：基因随机整合于染色体，易导致受体细胞基因灭活或转化基因不表达。基因灭活或转化基因不表达。1. 物理转化法物理转化法2. 化学转化法化学转化法（1）脂质体包埋法）脂质体包埋法 脂质体包裹脂质体包裹DNA，通过与受体细胞膜融合使，通过与受体细胞膜融合使DNA片段进入细胞。片段进入细胞。（2）磷酸钙共沉淀法）磷酸钙共沉淀法 DNA与磷酸钙形成共沉淀颗粒，吸附于细胞表与磷酸钙形成共沉淀颗粒，吸附于细胞表面，通过胞饮作用进入细胞。面，通过胞饮作用

14、进入细胞。（3）DEAE-葡聚糖吸附法葡聚糖吸附法 通过病毒感染的方式导入外源基因。通过病毒感染的方式导入外源基因。 病毒载体为缺陷型病毒，感染后将基因组转入细病毒载体为缺陷型病毒，感染后将基因组转入细胞，无法产生包装的病毒颗粒。胞，无法产生包装的病毒颗粒。 常用：腺病毒载体、逆转录病毒载体。常用：腺病毒载体、逆转录病毒载体。3. 生物学方法生物学方法第二节 动物细胞工程的应用一一. 医用蛋白质的生产医用蛋白质的生产1. 单克隆抗体单克隆抗体 一种一种B淋巴细胞能接受一种抗原决定簇的刺激，淋巴细胞能接受一种抗原决定簇的刺激，分化繁殖成为可分泌相应抗体的克隆系。大量分化繁殖成为可分泌相应抗体的克

15、隆系。大量B淋巴细胞可分泌出识别许多抗原决定簇的抗体。淋巴细胞可分泌出识别许多抗原决定簇的抗体。 单克隆抗体单克隆抗体：来源于单个：来源于单个B淋巴细胞的抗体，只能淋巴细胞的抗体，只能识别一种特定抗原决定簇。识别一种特定抗原决定簇。 单克隆抗体制备技术（单克隆抗体制备技术（B 淋巴细胞杂交瘤技术）淋巴细胞杂交瘤技术）：将骨髓瘤细胞与：将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合形成杂交瘤细淋巴细胞融合形成杂交瘤细胞，用于制备单克隆抗体。胞，用于制备单克隆抗体。 所获得的杂交瘤细胞既具有肿瘤细胞所获得的杂交瘤细胞既具有肿瘤细胞无限生长无限生长的的特性，又具有特性，又具有B淋巴细胞淋巴细胞分泌抗体分泌抗体的能力。

16、的能力。 单克隆抗体的优点：单克隆抗体的优点：专一性、均质性、灵敏性专一性、均质性、灵敏性以以及及无限量制备无限量制备的可能性。的可能性。单克隆抗体的制备过程单克隆抗体的制备过程应用价值：应用价值： 作为体外诊断试剂。作为体外诊断试剂。 作为体内诊断试剂，作为体内诊断试剂，用作肿瘤定位等。用作肿瘤定位等。 作为导向药物的载体作为导向药物的载体：单克隆抗体上连接：单克隆抗体上连接抗癌药物等抗癌药物等,特异地治特异地治疗癌症等疾病。疗癌症等疾病。-生物导弹生物导弹p 由于微生物缺乏蛋白质翻译后的加工修饰系统，由于微生物缺乏蛋白质翻译后的加工修饰系统，因此许多复杂人体蛋白必须用真核动物细胞表达。因此

17、许多复杂人体蛋白必须用真核动物细胞表达。如：如： 溶血栓药物溶血栓药物-组织型纤溶酶原激活剂组织型纤溶酶原激活剂（tPA） 血友病药物血友病药物凝血因子凝血因子 VIII 促红细胞生成素促红细胞生成素治疗肿瘤化疗或肾脏疾病导致的治疗肿瘤化疗或肾脏疾病导致的红细胞减少症红细胞减少症2. 复杂人体蛋白质复杂人体蛋白质二二. 基因工程动物的产生基因工程动物的产生基因工程动物基因工程动物转基因动物转基因动物（transgenic animal）基因剔除动物基因剔除动物（gene knockout animal）1、疾病动物模型、疾病动物模型目前已有多种遗传疾病的模型小鼠，是研究人类疾病目前已有多种遗传疾病的模型小鼠，是研究人类疾病的有利工具。的有利工具。2、动物生物反应器（、动物生物反应器（bioreactor）主要用于生产目的蛋白质，如：乳腺生物反应器主要用于生产目的蛋白质，如：乳腺生物反应器3、人类移植用器官、人类移植用器官通过遗传改造减少排斥。通过遗传改造减少排斥。三三. 基于细胞的组织工程基于细胞的组织工程 组织工程皮肤组织工程皮肤 组织工程膀胱组织工程膀胱 将体外培养的功能细胞植入患者体内，以代偿将体外培养的功能细胞植入患者体内，以代偿病变细胞所丧失的功能。病