表8土壤监测常规测定指标的分析方法和适用范围-土壤-微生物系统

1、土壤微生物监测常规测定指标的分析方法和适用范围分析项目名称分析项目代码分析方法代码分析方法名称是否推荐分析方法引用标准参考文献适用范围土壤微生物生物量的测定氯仿熏蒸培养法FI土壤微生物研究原理与方法P73-74土壤农业化学分析方法P228-230微生物生物量，碳、氮、 磷、硫氯仿熏蒸浸提法FEISO 14240-2陆地生态系统生物观测标准P230-233土壤微生物研究原理与方法P74-81土壤农业化学分析方法P231-233陆地生态系统生物观测数据质量保证与 质量控制P120-122微生物生物量，碳、氮、磷、硫基质诱导呼吸法SIRISO 14240-1土壤微生物研究原理与方法P81-82土壤农

2、业化学分析方法P233-234微生物生物量三磷酸腺苷ATP 法土壤微生物研究原理与方法P82-84土壤农业化学分析方法P235-236微生物生物量土壤麦角甾醇分析法土壤微生物研究原理与方法P84-85真菌生物量土壤几丁质分析法土壤微生物研究原理与方法P85-86真菌生物量土壤微生物群落结构的分析平板计数法GB/T 14643.2GB/T 14643.4陆地生态系统生物观测标准P235-240磷脂脂肪酸法(phospholipid fatty acid， PLFA)Lechevalier M.P.，1977陆地生态系统生物观测标准P240-244陆地生态系统生物观测数据质量保证 与质量控制 P1

3、22-124土壤微生物研究原理与方法P141-142土壤微生物功能多样性分析BIOLOG碳素利用法BIOLOG 公司 1989土壤微生物研究原理与方法P170-171功能基因组学分析土壤微生物研究原理与方法P171-172土壤微生物功能 多样性分析醌指纹法土壤微生物研究原理与方法P173-174脂肪酸谱图法-磷脂脂肪酸分析法PLFA土壤微生物研究原理与方法P174-178土壤总DNA提取 法Bourrain 法土壤微生物研究原理与方法P179-182Martin-Laurent 法土壤微生物研究原理与方法P179-182Tiedje 法土壤微生物研究原理与方法P179-182Janssen法土

4、壤微生物研究原理与方法P179-182Reddy 法土壤微生物研究原理与方法P179-182土壤总RNA提取 法Felske 法土壤微生物研究原理与方法P182-184Fleming 法土壤微生物研究原理与方法P182-184Chang 法土壤微生物研究原理与方法P182-184Burgmann 法土壤微生物研究原理与方法P182-184土壤微生物遗传多样性分析基于杂 交荧光原位杂交技术FISH土壤微生物研究原理与方法P185-189肽核酸探针杂交技术PNA土壤微生物研究原理与方法P189-190限制性片段长度多态性分析RFLP土壤微生物研究原理与方法P190-192陆地生态系统生物观测数据质

5、量保证 与质量控制P125-127土壤微生物遗传 多样性分析基于PCR克隆文库法土壤微生物研究原理与方法P192-204变性梯度凝胶电泳DGGE土壤微生物研究原理与方法P192-201，204-208单链构象多态性分析SSCP土壤微生物研究原理与方法P192-201，208-210核糖体基因间区分析RISA土壤微生物研究原理与方法P192-201，210-211随机扩增多态性分析RAPD土壤微生物研究原理与方法P192-201，211-213扩增片段长度多态性分析AFLP土壤微生物研究原理与方法P192-201，213-215末端限制性片段长度多态性分析T-RFLP土壤微生物研究原理与方法P1

6、92-201，215-217土壤呼吸作用密闭静止培养法GB/T 27855土壤微生物研究原理与方法P218-220土壤农业化学分析方法P239-240通气培养法土壤微生物研究原理与方法P220气相色谱法土壤微生物研究原理与方法P221纤维素分解埋布片法土壤微生物研究原理与方法P221-222尼龙袋法土壤微生物研究原理与方法P222土壤产甲烷培养基-气相色谱土壤微生物研究原理与方法P222-223土壤氨化作用土壤培养法GB/T 27854土壤微生物研究原理与方法P223-224土壤悬液法土壤微生物研究原理与方法P224-225土壤氮素净矿化作用差减法土壤微生物研究原理与方法P225土壤氮素总矿化

7、 作用15N稀释法土壤微生物研究原理与方法P225-226土壤硝化作用土壤培养法GB/T 27854土壤微生物研究原理与方法P227-228土壤农业化学分析方法P260-261净硝化作用土壤悬液法土壤微生物研究原理与方法P228-229土壤农业化学分析方法P261-262净硝化作用纯菌培养法土壤微生物研究原理与方法P229净硝化作用15n稀释法土壤微生物研究原理与方法P229-230总硝化作用土壤反硝化作用硝酸盐消失法土壤微生物研究原理与方法P231-232乙炔抑制法土壤微生物研究原理与方法P232-233土壤固氮作用土壤培养法土壤微生物研究原理与方法P233-234土壤悬液法土壤微生物研究原

8、理与方法P234-235乙炔复原法土壤微生物研究原理与方法P235-236土壤磷转化作用土壤培养法土壤微生物研究原理与方法P236-238淹水土壤铁复原 活性比色法土壤微生物研究原理与方法P239-240环流土壤中铁氧化性测定环流装置土壤微生物研究原理与方法P240氧化复原酶活性脱氢酶ISO 23753-1ISO 23753-2土壤微生物研究原理与方法P245-246过氧化氢酶土壤微生物研究原理与方法P246-247硝酸复原酶土壤微生物研究原理与方法P247-248多酚氧化酶土壤微生物研究原理与方法P248-249水解酶活性转化酶土壤微生物研究原理与方法P249-250脲酶土壤微生物研究原理与

9、方法P250-251土壤农业化学分析方法P249-252磷酸酶土壤微生物研究原理与方法P251-253土壤农业化学分析方法P252-254纤维素酶土壤微生物研究原理与方法P253-254蛋白酶土壤微生物研究原理与方法P254-255脂肪酶土壤微生物研究原理与方法P255-256酰胺酶土壤微生物研究原理与方法P256-257L-天冬氨酸酶土壤微生物研究原理与方法P257-2593 -葡萄糖苷酶土壤微生物研究原理与方法P259-260几丁质酶土壤微生物研究原理与方法P260-261芳基硫酸酯酶土壤微生物研究原理与方法P261-262土壤农业化学分析方法P254-255转移酶和裂解酶 活性果聚糖蔗糖

10、酶土壤微生物研究原理与方法P262-263L-组氨酸氨裂解酶土壤微生物研究原理与方法P263-265土壤呼吸的田问原位测定装置封闭式动态气室法CDC土壤微生物研究原理与方法P291开放式动态气室法ODC土壤微生物研究原理与方法P291-292封闭式静态气室法CSCLY/T 1220土壤微生物研究原理与方法P292-293土壤农业化学分析方法P240-241微气象法土壤微生物研究原理与方法P293-294土壤有机质周转 速率碳稳定同位素示踪技术土壤微生物研究原理与方法P295-297微生物的氮同位 素分馏效应氮稳定同位素示踪技术土壤微生物研究原理与方法P297-299稳定同位素核酸探针技术稳定同

11、位素核酸DNA探针技术DNA-SIP土壤微生物研究原理与方法P300-314稳定同位素核酸RNA探针技术RNA-SIP土壤微生物研究原理与方法P300-304，314-321其他方法：一、土壤DNA提取和纯化：方案1,参考1,21. 称取样品土样5g,参加灭菌的石英砂，液氮研磨;不要液氮研磨，这样子对 DNA伤害很大，几乎全部片段化了。可以加上PBS洗涤下土壤，一是能够去除些杂质，二是能够使得土壤处于悬浮状态，然后可以在涡旋仪上剧烈涡旋2-3min，使得土壤颗粒破碎。然后12000rpm离心5min，弃上清。2. 参加 13.5mL 的 DNA 提取 Buffer，100 微升 20mg/mL

12、 蛋白酶 K，37°C225rpm 摇 30min-2h3. 参加700微升20%SDS，65 C水浴2h,间隔15min颠倒摇匀数次；4. 6000rpm室温离心15min,收集中间液相层；向沉淀中参加3mLDNA提取液，300微升20%SDS，65C水浴30min，同上离心，收集中间液相层，合并；重复一次；可考虑再增加抽提一次。或者用 5mL而不是3mL。最后实在装不下了可以分在两个 50mL离心管里面离心。5. 向收集的液相层中参加等体积氯仿：异戊醇(24： 1)抽提一次，8000rpm离心10min，收集上部液相层；6. 第5步收集液相层中参加 0.1倍体积的乙酸钠，0.6倍

13、体积的异丙醇，4 C过夜沉淀；这个千万不要4度过夜啊，四度过夜你会发现很多的絮状悬浮物，我之前犯过类似错误，这个是SDS和高浓度的盐在低温条件下析出来了。室温放置1-2h就好。7. 过夜沉淀物12000rpm离心15min，弃上清；向沉淀中参加 10mL冷乙醇洗涤，12000rpm离心5min，弃上清；12000rpm离心30sec,移液枪析出残留液体；8. 室温自然枯燥沉淀，枯燥后向沉淀中参加 400微升TE溶解。方案2:购置 DNA 提取试剂盒，如 SoilMaster DNA Extraction Kit (Epicenter) 或 UltraClean Soil DNA Isolati

14、on Kit (MO BIO)二、DNA定量和质量检测：提取后的DNA使用紫外分光光度法进行浓度和纯度检测。DNA纯度以OD260/OD280比值来反映。当 OD60 /OD80比值1.8时，说明样品存在蛋白质或酚等杂质，可采用平衡酚/氯仿/异戊醇再抽提除去蛋白质或用乙醚抽提去除残留酚，再用无水乙醇沉淀，TE悬浮后再测定。当 OD60/OD280比值2.0,说明样品存在 RNA污染，可以用RNA酶处理样品去处RNA。和定量，应用1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA大小及完整度。三、土壤宏基因组测序将质检合格的土壤 DNA随机打断，加接头序列构建测序文库，利用Roche 454或Illumina Hi

15、seq系统进行测序反响。四、生物信息分析：1. 原始数据整理、过滤及质量评估： 应用中科院青能所自主开发的质量控制软件QC-Chain进行原始测序数据的质量控制，去除低质量碱基和read，并进行污染序列的监控(3)。2. 宏基因组拼接和基因预测：IDBA-UD( 4)，MetaGeneMark(5)等。应用基于宏基因组数据聚类算法的拼接工具，进行宏基因组拼接和基因预测，如3. 群落可视化分析：包括Parallel-META 2.0、MetaSee、Meta-Storm以及Meta-Mesh等工具，具有群落样本分析，群落样本可视化分析，群落样本比拟以及群落样本搜索和数据挖掘等功能。4. 基因功能

16、分析：*基因功能注释基因功能丰度差异分析*丰度差异的基因 GO富集分析*丰度差异的基因 KEGG富集分析*聚类分析热图*多元统计分析根据实验设计基于物种丰度分析：*稀释曲线* Alpha多样性分析*物种丰度差异分析*聚类分析热图*多元统计分析根据实验设计基于群落结构分析：*单样品物种分布多样品物种分布1. Zhou J, Bruns MA, Tiedje JM. DNA recovery from soils of diverse composition. Applied and environmental microbiology. 1996;62(2):316-22.2. Jackson

17、CR, Harper JP, Willoughby D, Roden EE, Churchill PF. A simple, efficient method for the separation of humic substances and DNA from environmental samples. Applied and environmental microbiology. 1997;63(12):4993-5.3. Zhou Q, Su X, Wang A, Xu J, Ning K. QC-Chain: Fast and Holistic Quality Control Method for Next-Generation Sequencing Data. PloS one. 2021;8(4):e60234.4. Peng Y, Leung HC, Yiu S-M, Chin FY .