dld006-蛋白定量(BCA法)-最强实验protocol

1、A dld Lsa boratory Manual ? All Rights Reserved蛋白定量Protein Quantitation【蛋白定量的背景知识】“蛋白定量”即蛋白质定量，蛋白质定量根据其目的分为全蛋白质的“总定量法”和特定蛋白质的 “个别定量法”。蛋白定量是生物学实验不可缺少的一部分。 为验证细胞裂解是否成功； 或为了将多个样品进行平行实验比较或标准化保存，需对细胞裂解液进行蛋白定量； 为了判定蛋白的产量，需对纯化好的蛋白进行定量； 为了将纯化好的蛋白用生物素或者报告酶进行标记，同样需首先对蛋白样品进行定量，以保证标记反应在适当的化学浓度下进行。蛋白定量分析涉及到生产科研的

2、多个领域及行业，也是生物学科、食品检验及打击掺假掺伪、临床检验、诊断疾病和质量检验中最常见的方法。【蛋白定量的方法】蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科常涉及的分析内容。在 生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，是一项经常进 行的非常重要的工作。蛋白质是一种十分重要的生物大分子，它的种类很 多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想 而又通用的蛋白质定量分析的方法带来了许多具体的因难。 现测定蛋白质含量方法有很多： 根据物理性质：紫外分光光度法； 根据化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、 Folin-酚试剂法（ Lowry 法）、BCA 法、胶体金法； 根据

3、染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法； 根据其他性质：荧光法；蛋白定量的测试方法有很多种，其中较为常见的有五种，分别是Bradford 法、 Bradford 斑点试验、Coomassie 斑点试验、紫外分光度检测法及 BCA 法这五种。当然，每种方法适用的情况都有所不同。实验最常用的蛋白定量方法为BCA 法和 Bradford 法 （也就是考马斯 染色法）BCA 蛋白定量和Bradford 法蛋白定量的区别（ 1） Bradford 法测得的主要是碱性氨基酸和芳香族氨基酸，BCA 则没有选择性；该方法用于大多数蛋白质定量是相当精确的，特别是用于小分子多肽定量，如核糖核酸酶或溶菌酶等。但是，去污

4、剂（裂解液）的浓度超过 0.2%则影响定量结果。如TritonX-100 ， SDS， NP-40 等。（ 2） BCA 法蛋白浓度定量是Cu2+在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成Cu+（ Biuret Reaction） ， Cu+和独特的BCA Solution A（含有 BCA）相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA 螯合一个Cu+， 形成紫色的反应复合物。 该水溶性的复合物在562nm 处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。Bradford 法蛋白定量是染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收波峰的改变，从 465nm 变为5

5、95nm， 光吸收增加。蛋白质染料复合物具有高的消光系数， 因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1g 蛋白 。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约需2min，结合物的颜色在1h 内是稳定的。一些阳离子，如K+， Na+， Mg2+， （NH4 ） 2SO4，乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如TritonX100 ， SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。由于染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。【内参（基因/蛋白）的背景知识】Western Blot 实验常用于检测蛋白表达量、蛋白表达产物的正确性等。相对于其他检测蛋白的方法

6、而言Western Blot 实验在蛋白的定性定量分析、与“目的蛋白”量的比较 方面更简单一些。在定量分析时，为排除各样本蛋白总量不同的干扰，WB 的每个样本的 “上样量” （并不仅仅指上样量的体积）即对应泳道的蛋白总量应该均一。因此需提前对各蛋白样本进行定量，使得各样本的蛋白浓度一致，如此 WB 时，当每泳道上样体积一致时，则对应的蛋白总量也一致。作为 Control， 应选择能在各个细胞都能稳定表达的内参基因（常见的内参基因有 -Actin ， GAPDH 等，具体需参考文献），如 WB 的结果显示内参基因一致，则表明本次实验各泳道的蛋白总量一致，实验也就具备了分析的前提和基础。内参即是内

7、部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白（Housekeeping Proteins），它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。虽然，顺利的时候Western Blot 做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦 做不出结果、假阳性、结果出现多条带、到底是一抗有问题还是二抗有问题毕竟

8、，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应不像“ 1+1 ”那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性。所以， 严谨的 Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果的分析非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮，怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker（ 用来确定蛋白条带对应的分子量大小）、空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照）、已知量标准产物的正对照，另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot 往往省略参照，导致结

9、果出现问题时无法分析结果，即便有结果也可能影响结果的分析。实际上内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot 比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础，特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析，所以需要内参。在国外发表的文章中，WesternBlotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting 实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各

10、种样品的蛋白浓度。如 UV 法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质如DNA 的干扰，且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA、 Bradford、 Lowry 等几种方法。BCA法与 Lowry 法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry、 BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容，但是对去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在 Weste

11、rn blotting 实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。在 Western Blot 中使用内参其实就是在WB 过程中另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot 显色或者发光体系是否正常。在 Western Blotting实验过程中使用内参的方法通常有以下三种：（ 1） 第一种是超级简便的标记内参使用法，只要在二抗孵育时加入HRP标记

12、内参抗体，按照正常操作即可;（ 2） 第二种是普通内参，当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测，然后使用Strip 缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。（ 3） 第三种 （最常用）， 当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker 的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开，然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行孵育，二抗孵育以及显色。常用的蛋白质内参有GAPDH 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-

13、phosphate dehydrogenase） 和细胞骨架蛋白beta-actin 或beta-tubulin。一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差10kDa 以上。因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的内参。【 -Actin、 GAPDH 、 Tubulin 的具体应用】actin 即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin 大 致 可分 为 六 种， 其 中 四种 是 不 同肌 肉 组 织特 异 性 的， 包括 alpha-skeletal muscle actin、 alpha-cardiac muscle actin、 alpha-smooth muscle

14、 actin 和 gamma-smooth muscle actin，其余两种广泛分布于各种组织中，包括beta-actin (- non-muscle) 和 gamma-non-muscle actin。这些不同的亚型组织分布是不一样的， 在肌肉组织中的beta-actin 分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。 因此不同的组织本来就应该选择不同的内参，不能一概而论的。Beta-actin 作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富。尽管最近有一些文章已经开始质疑 beta-actin 作为内参的有效性(

15、疑似对于上样量>20 g 的蛋白区分能力下降)，但是发文章应该还是没有问题的。至于其他的内参也是可以考虑用的，GAPDH( 甘油醛-3-磷酸脱氢酶)是参与糖酵解的一种关键酶，而tubulin 和 actin 类似，是细胞骨架的组成部分，但不是肌肉的主要成分，应该是一个代替品。上述三种内参同时发生变化的情况很少，需要具体分析。一旦出现上述三种内参同时发生变化，如果是总蛋白可以用胞核的内参如PCNA，TATA-box binding protein(TBP) 甚至线粒体的内参来代替，当然一般这种可能性出现的几率微乎其微。不同异构体表达对蛋白的检测是有很大的影响，买抗体前要好好熟悉自己的目的蛋

16、白，很多抗体杂不出条带其实未必是抗体质量的问题。很多公司的内参抗体是用抗原片段制备的，不同的公司选择的片段不一样。以最常用的beta-actin 为例， 有的公司选择N-端， 有的选择C-端。 选用 N- 端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys 16aa 作为抗原 制备抗 体 ( 单 抗和多 抗 ) 的 占大多 数，主 要有 Santa Cruz(Cat# sc-69879),sigma(Cat#A197等 )， ProSci(Cat# 3779)， Cell Signaling(Cat#4967) ， A

17、xxora PLATFORM(BET-A300) 等，这类抗体均不能检测心肌和横纹肌中的 actin 条带。选用C-端 16aa 短肽作为抗原制备抗体的主要有AxxoraPLATFORM(PSC-3777) ， EPITOMICS(1784-1,1854-1 等 )，这类抗体可以在肌肉细胞中检测到actin 阳性信号。有时候在实验中检测内参时产生“组织特异性 ”，就是由于抗体选择不对造成的。actin 几种异构体存在组织分布特异性，不同型actin 之间具有较高的序列相似性(>90%)。 -actin 是分布于非肌细胞中的一种骨架蛋白，选择作 -actin 内参时首先得保证是组织广泛表达

18、的(尤其是做蛋白的组织表达谱时 )。那么制备 -actin 抗体的抗原应该是选用与actin 其它异构体一致的氨基酸序列。公司制备抗体是选用 -actin 的某一段小短肽作为免疫原，可能会因为选取的短肽在不同型actin 之间保守与否，而导致所制备抗体具有一定的组织特异性.如选取的短肽仅在beta型存在， 所得抗体就仅能检测非肌细胞中的actin， 而选取的短肽在六型中均存在,则此抗体除非肌细胞外，还可以检测cardiac， skeletal， smooth muscle 细胞的 actin。Western Blot 实验中选择内参作为参照体系对于实验结果的分析具有很好的说明性。内参的选择往往

19、使用一些常见的持家基因(管家基因)，常用蛋白内参有GAPDH 、 beta-actin 等。 Western Blot实验中内参的选择及其使用方法都会直接影响对实验结果的分析。【 BCA 法蛋白定量的原理】Cu2+在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成Cu+， Cu+和独特的BCASolution A(含有BCA)相互作用产生敏感的颜色反应。从原来的苹果绿色螯合成紫蓝色的复合物。在 562nm 处显示强烈的吸光性，且吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。BCA 法蛋白定量的工作范围BCA 法测定蛋白质浓度的范围是20 g/m-l200 g/ml【碧云天BC

20、A 试剂盒特点简介】碧云天 BCA 试剂盒官方说明BCA 蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit) 是根据目前世界上最常用的两种蛋白浓度检测方法之一BCA 法研制而成，实现了蛋白浓度测定的简单、高稳定性、高灵敏度和高兼容性。灵敏度高，检测浓度下限达到25 g/m，最小检测蛋白量达到l0.5 g ，待测样品体积为1-20l 。在 50-2000 g/ml浓度范围内有较好的线性关系。BCA 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的 SDS， 5%的 Triton X-100 ， 5%的 Tween 20、 60、 80。但本试剂盒受螯合剂和

21、略高浓度的还原剂的影响：需确保 EDTA 低于 10mM， 无 EGTA， 二硫苏糖醇(DTT) 低于1mM， -巯基乙醇BME ( -Mercaptoethanol)低于0.01%。不适用 BCA 法时建议试用碧云天生产的Bradford 蛋白浓度测定试剂盒 (P0006)。BCA法蛋白定量实验步骤】以具体实验为例01. 检查制冰机里的冰是否足够；并打开37 生化培养箱；一般推荐每天上午裂解细胞，收取蛋白样品，下午立刻行BCA法进行蛋白定量实验，如此可以防止蛋白降解；如果裂解细胞第二天开始进行蛋白定量实验，则务必检查是否有足够的冰；02. 待检测的蛋白样品插置冰上且保存在4 冰箱待用；03.

22、 检查预先配制的蛋白标准品是否够用，如果不足，则重新配制；蛋白标准品在BCA 试剂盒（碧云天）内，由厂家提前配制好贮存溶液，用于标准曲线的测定；具体步骤为：完全溶解蛋白标准品，取10l 稀释至100l ，使终浓度为0.5mg/ml。一般而言，蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但为了简便起见，也可以用0.9% NaCl 溶液或 PBS稀释标准品。稀释后的 0.5mg/ml 蛋白标准可以放置在-20 长期保存。04.EP 管； 由于 BCA 法需制作标准曲线，故即便样本量不大，也需要较多的EP管；如样本量较大，以及需要双梯度稀释蛋白样本时，则需要大量的EP管，因此需提前标记好待用；

23、一般标准曲线8 个； 样本则需标记3 套 EP 管， 20 倍稀释 （ 1L 样品） ，10倍稀释 （ 2L 样品） ， 最终的调平蛋白浓度（高浓度蛋白样品补齐之后）；加上此前裂解细胞提取蛋白所需的EP 管（通常是一天之内进行），因此需要 4套 EP管； 为实验方便，用于配制梯度稀释的蛋白样品的EP 管的标记，可以使用简写，但操作时需严格得从始至终一一对应；05. 估算拟加BCA 工作液检测的孔数；标准曲线16孔，蛋白样品每个样本 2 个副孔，共3 个孔；考虑到BCA 工作液的价格，一般预留10% 配制；06. 将上述实验方案简单绘制于检测使用的96 孔板上， 放在冰上孵育待用；蛋白极易降解，

24、因此实验操作时，除需佩戴口罩外，全程皆应在冰上进行；有条件时，盛放蛋白样品的EP 管， 96孔板要进行提前预冷；07. 开始配制标准曲线（蛋白标准品线性稀释液）以及样品孔的“上样溶液 ”；按照汇总配制的原则，标准曲线按2.5 孔体积配制，样品孔按3.5孔体积配制；配好后，插冰待用；（ 1）蛋白标准曲线梯度样品的配制将标准品按0、1 、2、4、8、12、16、20l加到 96 孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20l ， 相当于标准品浓度分别为0、 0.025、 0.05、 0.1、0.2、 0.3、 0.4、 0.5mg/ml；蛋白标准品体积（ L ）01248121620对应蛋白浓度（

25、mg/ml）00.0250.050.10.20.30.40.5实际按照2.5个孔汇总配制；单块 96 孔板（ 1 根标准曲线）（ 2.5well）蛋白标准品体积（ L ）01248121620应加蛋白标准品体积（ L ）02.551020304050应补充蛋白稀释液体积（ L ）5047.545403020100两块 96 孔板（ 2 根标准曲线）（ 5well） （样本量较大时）蛋白标准品体积（ L ）01248121620应加蛋白标准品体积（ L ）051020406080100应补充蛋白稀释液体积（ L ）1009590806040200上述为理想情况；一般实验时，蛋白样本量不会太大，同

26、时制作两根标准曲线也费时费力，一般制作一根即可；如一定要制作两根标准曲线，则检测时，一块96 孔板应将全部样品上样（比如都上20 倍稀释的样），如此才可以根据该标准曲线进行定量（样品太多跨两块96 孔板的话，则涉及到使用哪一根标准曲线的问题）；（ 2）待检测蛋白样品的配制稀释20倍（样品1L ）汇总配方：3.5 L sample + 66.5 L PBS稀释10倍（样品2L ）汇总配方：7 L sample + 63 L PBS稀释的目的是因为BCA 法测定蛋白浓度有“工作范围”； 一般而言，裂解所得的蛋白样品浓度过高，需进行稀释方能检出；常见的稀释倍数为10 倍，即 2L 样品 +18 L

27、PBS；但个别情况浓度还较高，为免重复实验，一般还平行补充一组20 倍稀释的样本；08. 根据步骤05 估算的总孔数配制BCA工作液； 一般以 A液体积为准，忽略B 液体积； A 液 :B 液 =50:1;BCA 工作液需现用现配，一般在样本加入96 孔前配制即可；09. 将步骤 07 所配置的各“上样蛋白溶液”，按每孔20L 的体积加入到对应孔中； 96 孔板在实验时容易看错，操作时应严格“唱名”，一一对应； 同一样品同一梯度可不换Tip 头， 但吸取不同的“上样蛋白溶液”时则需及时更换Tip 头；此外，当移液枪残留液体较多时，则每加完一上样孔，需更换 Tip 头； 先加20L的 “上样蛋白

28、溶液”再加200L 的 BCA 工作液看似违背加液体的原则（只能小体积加入大体积），但采取此办法，一则加样品时不需要每孔都要换Tip 头，二则节约更换Tip 头的时间，可以使得各孔内BCA反应更均一； 操作时，96 孔板应始终置于冰上；10. 每检测孔加入200 LBCA工作液；加 BCA 工作液前，打匀勿忘记；11. 将待检测96 孔板放入37 生化培养箱内，孵育30 min； 也可以室温放置2 小时， 或 60放置30 分钟； 如忘记打开生化培养箱，则放入60烘箱内； BCA 法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间；12. 将待检测96 孔板放入酶标仪内，如实验室的酶标仪非全波长而又没有562nm 波长处测定OD 值；562nm 波长的滤光片，则选取540-595nm 之间的其他波长的滤光片进行检测；蛋白定量（蛋白总量配平）的数据处理本次实验酶标仪检测结果如下所示：01. 数据区域划分待用，并审核是否有