健康评估：014临床微生物学

1、临床微生物学 Clinical Microbiology诊断微生物学 Diagnostic Microbiology临床病原学检验 Clinical Pathogen Detection感染性疾病的实验室检查 Laboratory Tests for Infectious Diseases2基本知识和概念 临床医学领域里的四大类微生物：病毒、细菌、真菌、寄生虫。 正常微生物群： normal flora 正常情况下，在人体皮肤表面、开放的腔道内定植的微生物群，其种类、数量、比例等在一定的时间段内具有相对稳定性。 感染： infection 外来微生物的有害的定植。 感染的范畴比感染性疾病的范畴

2、大，包含了后者的含义。3基本知识和概念 感染性疾病： infectious diseases 微生物导致的有临床证据（包括症状、体征、免疫学反应、微生物学证据）的疾病。 传染性疾病： contagious diseases，communicable diseases 如果感染性疾病可以在人际（同一种属内不同个体间）传播，则可以称为传染性疾病。4基本知识和概念 医院感染： Nosocomial infections，Hospital acquired infections 在医院内获得的一切感染。即病人入院时不存在，也不处于潜伏期，而是在入院后引起的感染。包括在医院内获得而出院后发病的感染。 和

3、社区获得性感染（community acquired infections）相对应。 不知道潜伏期时，一般以入院48hr为界进行判断。 机会感染： Opportunistic infection 免疫正常（immunocompetent）宿主通常没有的，免疫受损（immunocompromised）患者才会罹患的感染。 其病原为机会病原（opportunistic pathogens）。5感染性疾病学是临床医学的重要分支1. 组织/系统性疾病 systematic diseases： 其中结缔组织病可累及多系统 感染会诱发、加重这些疾病并使这些疾病复杂化、预后不良。2. 肿瘤性疾病 tumor

4、ous diseases：全世界有1/5癌症由慢性感染引起，如HBV & HPV （by WHO）3. 感染性疾病 infectious diseases 上述3种疾病发生率最高。 感染性疾病和肿瘤性疾病：几乎所有专科都有涉及 其他疾病包括：遗传、营养、职业病、精神疾病、物理因素疾病、中毒（包括微生物产生的毒素）6感染性疾病的诊、治、防控ME即微生物学证据（microbiological evidence） 三层诊断：possible diagnosis，probable.，proven/definite. 四层用药： 两源控制： source control 感染灶控制外科 控制感染

5、源医生和感控部门主要涉及：临床医学、临床药学、临床微生物学、感染控制学4个专业诊断分层诊断分层风险因素风险因素临床表现临床表现*初步的初步的ME明确的明确的ME对应的用药对应的用药选药的关键选药的关键无感染有无无无预防用药病原谱/病原拟诊断有有无无经验治疗病原谱极似诊断有有/无？有无抢先治疗最可能病原确定诊断有有有有靶向治疗确定的病原7ATS American Thoracic Society ：美国胸科学会IDSA Infectious Diseases Society of America ：美国感染性疾病学会De-escalate antibiotics：降阶梯应用抗生素Am J Res

6、pir Crit Care Med Vol 171. pp 388416, 2005Guidelines for the management of adults with hospital-acquired, ventilator-associated, and healthcare-associated pneumonia. 8临床微生物学 Clinical Microbiology 概念： 对临床标本和相关环境标本进行快速、准确地微生物学检验 为感染性疾病的诊断、治疗、预防和控制提供证据 它是实验室医学（Laboratory Medicine）的重要分支 和其他实验室医学分支相区别的特点

7、在于： 检测对象：微生物及其产物、微生物导致的人体炎症、免疫反应标志物 既可以为诊断，也可以为治疗提供证据，还可以为感控提供证据。 和其他实验室医学分支一样，按检验流程可分为三阶段： 分析前阶段（pre-analytical phase） 分析中阶段（analytical phase） 分析后阶段（post-analytical phase）9分析前阶段（pre-analytical phase） 从疑似某项疾病需要进行相应某项检查的判断开始到实验室接到标本、明确检查项目、确认标本合格为止。 微生物学检查： 基于拟诊断进行。 拟诊断主要考虑：部位、病原、严重性和患者的一般状态分析前环节由临床医

8、生负责临床微生物学从业者有宣传、教育、解释的义务10微生物学检查分析前环节的要素1. 充分性/适应证：前提是某部位的感染明确/基本明确2. 针对性：病原谱/可能的病原经验治疗的前提3. 必要性：有些感染不必进行病原学检查，如免疫正常患者轻症URTI，如免疫正常患者社区UTI。重症感染/免疫低下患者机会感染/医院感染/暴发时，尽量要做病原学检查。4. 可行性：现实可行、没有禁忌（有创检查，如脑脊液，颅内高压时不可以抽取）5. 根据上述因素：确定检查的方法，标本的种类，采集的部位、时机、频率、量、方式6. 检验申请，无菌操作采集标本7. 运输：迅速送检8. 质量判断、标本接收11标本留取时的两个关

9、键因素 无菌理念/行为：标本不要被污染，也不要导致病原播散、传播 患者正常微生物群 操作者正常微生物群 环境微生物 抗微生物药物/抗生素影响巨大：会使阳性率大幅度下降 使用前 停药后 或血药浓度最低时12标本留取送检环节的具体要求 WHO1. 全程无菌操作2. 收集前后洗手3. 在合适的病程留取4. 确定标本能够代表感染过程/在真正病灶处留取5. 放在无菌容器/正确的容器，如厌氧菌6. 盖紧盖子（有螺纹口），避免溢出7. 有无菌的二次包装8. 标识和信息9. 立即运送，环境敏感菌10.容器中不能添加防腐剂13质量判断 痰： SEC10/LPF 抽吸痰：SEC1菌体/20个油镜视野 BALF：（

10、SEC/全部细胞）1 尿：SEC10PMN/mm3。拒绝：SEC3，染色见到3种以上菌体 体表伤口：SEC10ml）。不做普通培养（3日规则） 对涂片、培养来讲，成形便为不合格标本。 其他靶向检查：霍乱弧菌、Eco O157、病毒20正常无微生物部位液体 指脑脊液CSF、心包积液、胸水、腹水/盆腔积液/后穹窿穿刺液、关节液、腹膜透析液 骨髓BM 适应征：疑似相应部位感染 涂片：革兰染色、抗酸染色、脑脊液涂片找新型隐球菌 普通培养 强烈建议增菌培养：同血培养要求。1ml时注入新生儿培养瓶（CSF、BM） 脑脊液乳酸测定21血管内插管和CRI、CRBSI 适应征：疑似CRI、CRBSI1. 局部分

11、泌物、组织：可以镜检、培养2. 导管培养：5cm, 5-7cm（包括皮内段，不要仅送检管端），直接或置于1ml NS送检3. 导管血培养：经导管和经皮同时抽血，通过DTTP诊断 导管定量培养阈值：1000、100CFU/ml DTTP：差异报警时间，经皮静脉血培养和经导管静脉血培养报警时间的差。2hr为CRBSI诊断阈值。22血液培养和菌血症、脓毒症1. 适应征：SIRS或T38；局部中重度感染2. 时机：应用抗生素前，或在血药浓度最低时；发热初始，峰前，或寒战后立即采血3. 一针血，无论几瓶，都是一套。成人24hr内取3套，危重患者4套。新生儿1-2套。4. 建议：首套有氧瓶无氧瓶；第2、3

12、套为有氧瓶。无氧瓶不必都做。 有可能才做：怀疑菌血症感染源在肠道、封闭脓腔. 仅首套做5. 3套在3个不同部位抽取。如果有血管内插管，并且怀疑该导管CRBSI，则一个经导管，一个经皮抽取。6. 严格消毒7. 每瓶：成人10ml，新生儿1ml8. 时间：手写在送检单上，精确到分。TTP的前提。9. 感染源的判断非常重要：同时送检相应部位的标本23可能污染菌严格消毒和接种时，污染率在3-5%污染菌需要回报，但不必做药敏AST。Basic laboratory procedure in clinical bacteriology，2th ，by WHO，2003常见皮肤定植菌：1.类白喉杆菌（除杰氏

13、棒杆菌）2.丙酸杆菌属3.芽孢杆菌（除炭疽芽孢杆菌）4.微球菌 Micrococcus spp.5.SCoN ， Coagulase-negative staphylococcus ：血浆凝固酶阴性葡萄球菌，包括表皮葡萄球菌6.草绿色链球菌7.气球菌 Aerococcus spp.Am J Infect Control 2008;36:309-3224分析中阶段（analytical phase） 从实验室接到标本、明确检查项目、确认标本合格开始发出正式报告为止。 该环节由临床微生物学负责。 检查分类： 直接检查：形态学、免疫学、分子生物学、炎症指标、代谢产物、毒素、计数. 基于培养进行的检查

14、：培养、鉴定、药敏，基于分离株的分型、毒素测定. 靶向检查：目标明确，如涂片找淋菌，淋菌培养 非靶向检查：目标不明确，如尿革兰染色镜检，尿培养；再如Broad-range PCR25形态学，主要是涂片镜检 直接检查，可靶向/可非靶向1. 病毒：基于电镜，临床实验室很少应用2. 细菌：革兰染色、抗酸染色.3. 真菌：酚棉兰染色、墨汁染色.4. 寄生虫：肉眼、血涂片查疟原虫. 单克隆抗体结合荧光技术26体现形态学诊断价值的疾病 霍乱弧菌的动力试验和制动试验，后者结合了单克隆抗体 脑脊液中的细菌、真菌 支气管肺泡灌洗液，吞噬菌体的嗜中性粒细胞比例超过5，有诊断价值Am J Infect Contro

15、l 2008;36:309-32 呼吸道标本抗酸染色 细菌性阴道病，假丝酵母菌性阴道炎 男性生殖道分泌物中，嗜中性粒细胞吞噬的革兰阴性双球菌：淋病奈瑟菌 感染性心内膜炎：Duke标准的升级版Clinical Infectious Diseases 2000;30:6338 无菌部位查见菌丝、酵母细胞对真菌性感染有确诊价值。Clinical Infectious Diseases 2008; 46:181321272006 01 19 男54岁，脑脊液 ；近4个月的治疗，鞘内注射AmpB仍未清除，死亡。浓度大幅度下降；荚膜消失耐药（原发耐药；继发耐药）？脑膜脑炎？墨汁染色 未染色28免疫学、分子

16、生物学、炎症指标 直接检查，一般都是靶向检查 免疫学：抗原、抗体、细胞学 四大类微生物感染都有应用 病毒性感染主要靠免疫学方法进行诊断 细胞学：结核感染T淋巴细胞干扰素释放试验 分子生物学：PCR、探针. 四大类微生物感染都有应用 多为靶向检查：如结核PCR、CMV PCR Broad-range PCR为诊断细菌的非靶向检查 炎症指标 WBC、CRP、ESR、Fib 降钙素原（procalcitonin，PCT）：细菌性感染标志、和感染严重程度成正比、可控制抗生素使用29培养、鉴定 基于培养的检查，可靶向/可非靶向 分离到微生物，并确认为是病原感染性疾病确诊 感染性疾病确诊微生物学诊断 鉴定

17、方法： 形态学：寄生虫领域主要方法， 四类微生物都有应用 生物化学/底物色原法：细菌学领域主要方法，真菌学领域有应用 免疫学：病毒学领域主要方法， 四类微生物都有应用 分子生物学： 四类微生物都有应用 分析化学：细菌/真菌学领域近期进展（质谱法） 药敏性：细菌学领域有应用 .30药物敏感试验和特殊耐药性 Antimicrobial Susceptibility Test ，AST 基于培养的检查，都是靶向检查 辅助治疗：靶向治疗的前提，经验治疗的流行病学依据 细菌/真菌学领域AST方法： 稀释法：参考方法 琼脂扩散法：常规方法 E-test 联合药敏试验 简化稀释法：手工、仪器 直接药敏试验：

18、血培养阳性后 AST执行标准：美国CLSI文件（试验药物、折点、解释）31肉汤稀释法 broth dilution test 无细菌生长的孔中最低的抗生素浓度即MIC； 无细菌生长的孔中肉汤重新接种在无抗生素培养基上，无细菌生长的最低的抗生素浓度即MLC/MBC 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 对照 对照 质控32 琼脂扩散法disk agar diffusion test 33AST结果解释 MIC： 最低抑菌浓度，Minimal inhibitory concentration 抑制特定微生物生长的最低药物浓度 敏感： susceptible，S 即表示测试菌株

19、可被测试药物常规剂量给药后在感染部位达到的药物浓度所抑制。 中介： intermediate，I 即表示测试菌株MIC接近通常可达到的血液或体液药物浓度，治疗反应率低于敏感株；在药物的生理浓集区或提高给药剂量可能有疗效。 耐药： resistant，R 即表示测试菌株不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制，临床治疗无效；和/或测试菌株有特殊耐药机制，临床治疗效果不明显。34特殊耐药性 ESBLs，extended-spectrum -lactamases，产超广谱-内酰胺酶菌株 MRSA，methicillin resistance Staphylococcus aureus ，耐甲

20、氧西林金黄色葡萄球菌 VRSA，vancomycin resistance Staphylococcus aureus PRSP，penicillin resistance Streptococcus pneumonia VRE，vancomycin resistance Enterococcus pan-resistant Acinetobacter and Pseudomonas CRE：carbapenem-resistant Enterobacteriaceae ，碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌 D-zone test35 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 又名：耐苯唑西林金黄色葡萄球菌 （Oxacillin resistance staphylococcus aureus，ORSA ） 表型试验：头孢西丁（FOX） 19 mm 对-内酰胺类（lactam）药物耐药 治疗选用糖肽类（万古霉素）和链阳霉素等Oxacillin 苯唑西林头孢西丁 苯唑西林MRSA methicillin resistance staphylococcus aureus36分析后阶段（post-analytical phase） 从实验室发出正式报告开始到将检验信息有机融入对患者的诊治之中，并根据后续信息对检验结果进行反思和反馈调整 临床医