规模化、集约化养殖禽病防控新技术

1、规模化、集约化养殖禽病防控新技术一、实施生物安全技术 做好生物安全是避免疾病发生的最佳方法。一个好的生物安全体系将发现并控制疾病侵入养殖场的各种最可能的途径。（一）我国规模化养殖场生物安全问题1首先是养殖业本身存在的问题养殖模式多样化；人畜混居、多种经营、多品种、多批次、大而全/ 小而全饲养；活畜禽当街宰杀；发病立即卖出去，或扔于粪堆、当街或水体；病鸡/ 死鸡交易；粪便露天堆放；此外养殖企业自身的不规范生产、养殖条件差、营养差（什么行情用什么料）、管理粗放等。2种禽群存在的问题存在蛋传疫病（白痢、支原体、白血病、贫血等）影响后代的健康和生产性能；种鸡、商品鸡使用的活疫苗带来的外源性病原微生物污

2、染问题；非SPF 蛋生产的活毒疫苗携带的蛋传性病原造成的人工感染，普通鸡胚生产的灭活疫苗，由于卵黄抗体的存在，导致的抗原量不足，造成免疫失败。3疫苗存在的问题我国明确规定，从2008 年7月1日起，家禽的活毒疫苗必须用SPD生产，我国SPF 蛋的数量存在严重不足，其次质量也存在很多问题。监测表明，SPF 鸡群也存在着病原微生物的污染。存在着用普通鸡胚或鸡胚成纤维细胞制备的活疫苗，且污染支原体、鸡传染性支气管炎病毒、鸡淋巴白血病病毒、传染性贫血因子、网状内皮增生症病毒、呼肠弧病毒、鸡传染性法氏囊病病毒等。鸡胚中的母源抗体可干扰接种疫苗病毒的繁殖，直接影响疫苗的质量。如免疫含甲醛浓度过高的灭活疫苗

3、后，高峰期产蛋率仅维持在65%74%。甲醛超过国际规定的1.48倍，致使产蛋鸡体内雌二醇减量，由此影响卵子及子宫发育，产蛋率下降21%22.5%，免疫8倍甲醛含量超标的疫苗的鸡可见鸡冠萎缩、苍白，剖检见成熟卵泡数量减少，卵子体积萎缩，卵泡颜色由黄色变成墨绿色，子宫腔体积萎缩、严重出现卵黄破裂，形成卵黄性腹膜炎。（二）实施生物安全技术1严格控制进入养殖场的人员2严格控制养殖场的器械使用养殖场自己的工作人员或器械进行接种疫苗、转群、断喙，每个鸡舍的工作人员都不交叉。为了将生物安全的风险降到最低， 制定关于外出人员和器械进行接种疫苗，分笼和断喙的规程。3防止在老母鸡、淘汰病死鸡时将疾病引入鸡舍运输老

4、母鸡、死淘鸡的的工作人员和货车往往会去过其它养殖场， 这样就很容易携带病原菌，必须严格消毒，走专门的通道。4严格实施全进全出制养殖场只养殖单一日龄的鸡群。鸡舍在设计时应是封闭的，避免将鸡群暴露给野禽从而传播疾病。另外对于死鸡要进行及时无害化处理。5避免啮齿类进入鸡舍鸡舍的周边应该铺设有宽度为1m的碎石或鹅卵石，以避免啮齿类进入鸡舍。饲料和鸡蛋应该储藏在不受啮齿类动物影响处， 在储藏地的周围应设置大量的饵毒室，并放置有效的灭鼠药。二、病毒疾病防控新技术 -RNA干扰技术1RNA干扰的概念 RNA干扰是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这

5、种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默（一）RNA干扰过程主要有两个步骤：1长双链RNA被细胞源性的双链RNA特异的核酸酶切成21-23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA（small interfering RNA）。2小干扰性RNA与细胞源性的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RISC），该复合体可识别与小干扰性RNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断。3RNA干扰抗病毒感染RNA干扰的优点效果好：只要抑制病毒蛋白的合成，病毒就不可能存活和繁殖；特异性强：只针对病毒蛋白，对哺乳动物的蛋白合无抑制作用；使用方便：注射一次，有效期至少半年，长至

6、终身；无副作用：拟使用一种改造的质粒载体，这种质粒载体的安全性已经得到了广泛认可；易于设计、构建、建造，且成本低廉，适于规模化生产，一旦具有干扰作用的质粒载体构建成功，就可以无限制的增殖。具有预防和治疗双重效果。化学性质稳定，不怕高温，具有良好的耐热性，便于保存和运输。 RNA干扰抗禽病毒感染RNA干扰抗禽流感病毒感染 核蛋白(NP)基因、核酸聚合酶(PA)是AIV转录与复制所必需的基因,且在各型流感病毒中的序列都相当保守。在体内外试验中,联合使用针对NP与PA的siRNA的抗AIV效应均已得到验证,并已有向临床发展的可能。在体外试验中,采用来自香港、波多黎克4株高致病H5、H7亚型的AIV,

7、针对NP与PA的siRNA均能抑制这些AIV的复制及降低病毒滴度,并被证实抗病毒机制属于特异的RNAi而非IFN效应。RNA干扰抗鸡传染性支气管炎病毒感染 鸡传染性支气管炎病毒（IBV）可引起鸡急性呼吸道病变、肾脏病变、生殖道等病变。IBV血清型众多,而且不同血清型之间的交叉保护很小,给预防和控制带来了很大难度。 筛选并设计IBV的N基因的小干扰RNA，进行体内外实验，结果表明，N基因的小干扰RNA均能抑制IBV的增殖，产生明显的干扰作用。三、新型检测技术（一）实时荧光定量PCR/RT-PCR技术1概念实时荧光定量PCR/RT-PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累积实

8、时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。2实时荧光定量PCR/RT-PCR技术特点特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等3实时荧光定量PCR 的检测方法类型探针类Taqman 探针该探针是长度为20 24 bp 的寡核苷酸，在其5'末端标记1 个荧光报告基团，3'末端标记1 个荧光淬灭基团，其序列与2 个引物包含序列内的1 段DNA模板完全互补。TaqmanMGB 探针TaqmanMGB 探针是在Taqman 探针的基础上改进的，在探针的3端增加了小槽黏结剂( MGB) 分子，这种物质能够结合在双链DNA 小沟部位，使识别性高，

9、无无背景荧光。分子信标分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，环部大小为1535 bp，能与靶DNA 序列互补，茎部由GC 含量较高的与靶DNA 无序列同源性的互补序列构成，探针的5端与3端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团。特点：探针可循环利用，适用于检测点突变，特异性更明显。双杂交探针该技术是将2条探针中的1条在5端标记荧光，1 条在3端标记荧光，其中一个为受体荧光基团，另一个为供体荧光基团，2个探针可与模板同1条链相邻的序列杂交。特点：提高特异性，淬灭效率高。复合探针复合探针结合了分子信标和杂交探针的优点，由荧光探针和淬灭探针组成，荧光探针长25个碱基左右，5端标记荧光基团，3

10、端磷酸化防止被延伸，淬灭探针长15个碱基左右，3端标记淬灭基团。优点：使用非荧光淬灭剂，本底低，对扩增效率影响小，探针设计、合成、标记、纯化方便，而且探针特异性较强、灵敏度较高，可以用来鉴别单碱基变异。染料类SYBR Green 荧光染料SYBR Green 是一种非饱和菁类荧光素，可以嵌合于DNA 双链结构的小沟中，非特异地与dsDNA分子结合。优点：简便，降低了检测成本，可定量。LC Green TM 荧光染料LC Green TM 荧光染料是新出现的一种dsDNA结合染料，能够与dsDNA 分子完全结合直接加入PCR 反应体系中，高浓度的LC Green TM 不会抑制PCR 反应。优点

11、：可得到更强的荧光信号。法简便、快速、准确性高、成本低，优于SYBR Green染料法。4应用细胞因子的表达分析应用实时荧光定量PCR 技术分析细胞因子的mRNA的表达，对其进行定量，来估算其蛋白表达量，一是可以对疾病进行诊断，二是阐明许多炎症反应、自身免疫性疾病、器官移植排异中的免疫致病机。病原体的分子检测该技术不仅能对病原体定性，而且还能对病原体DNA 或RNA 序列准确定量，同时对整个病程中潜在病原体的复活等进行动态研究，从而对疾病进行早期诊断、药物疗效观察、病情判断及预后观察等。谢永平等应用实时荧光定量PCR技术，以鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白( OmpA) 基因保守区序列, 设计引物和探针

12、, 建立了直接检测鸭疫里默氏杆菌的实时荧光定量PCR 快速方法。适用于RA 的快速诊断、流行病学调查、种鸭引进隔离检疫、活鸭及其产品国内市场和进出口检验检疫。（二）量子点技术由于量子点技术具有吸收光谱宽、发射光谱窄且发射光波长不受激发光波长影响等优点，目前已被广泛地应用于生物成像、生物检测及病毒检测及病毒分型等领域。1量子点的组成量子点是一种新型的纳米材料。量子点或半导体纳米晶体目前多由II一VI (CdS，CdSe，CdTe等)或者III一V族(GaAs，InGaAS，InP等)等化学元素构成的纳米颗粒。其中CdX(X=Se，S，Te等)为目前研究较多及应用较广的量子点。由于光谱禁阻作用，当

13、这些单一或者核一壳结构纳米颗粒的直径小于其波尔直径时，它们便能表现出其特有的光谱特性及理化性质。2量子点的结构将一层半导体材料覆盖于量子点表面，形成一种核一壳结构。外面的半导体覆盖材料能起到保护核心量子点的作用，并且使得消光系数显著增加，增强荧光的发射。3量子点的优越性量子点具有广泛的激发光谱量子点的激发光波长范围很宽，只要激发光能量大于量子点的最小激发光能量，都能激发量子点发射荧光。狭窄对称的量子点荧光谱峰在不同光谱特征量子点同时使用时，能够避免荧光发射光谱的重叠 (overlaP)，从而能够更容易区分不同的量子点，实现在同一样品中对不同生物分子的同时标记与识别。量子点的颜色可控性通过控制量

14、子点直径，能够得到具有不同荧光发射波长的量子点。并且不同大小的量子点能够被同一波长的激发光所激发，从而发出颜色不同的荧光，实现了一元激发，多元发射，同时检测。量子点荧光稳定性由无机物构成的量子点更加稳定，能够经受长时间的光激发而不会出现光漂白现象，其荧光寿命相较于传统的有机荧光分子延长了100多倍。这一特性能够对量子点标记的靶标分子进行长时间持续观察。量子点的生物相容性量子点，特别是经生物相容性修饰后的量子点，不仅能够特异性的与生物分子相连接，而且对生物体的毒性也很低。量子点高双光子吸收截面量子点与普通有机荧光染料分子比较，具有较高的双光子吸收截面比一般的有机荧光分子高出两到三个数量级。双光子

15、激发波长大约是单光子激发波长的一倍，并且波长较长的光子相对不易为细胞吸收，所以对活细胞造成的光学毒性会更小。3量子点技术的应用禽流感病毒的检测与分型首先将量子点与特异性的核酸探针相偶联，与此同时将磁珠与另一段识别同一病毒RNA分子的核酸探针偶联。这样，探针分子与病毒RNA结合成杂交分子后便形成量子点偶联探针一病毒RNA一磁珠偶联探针的“三明治”复合物。通过磁分离作用，将含有量子点的复合物分离、富集起来。最后通过对量子点荧光信号的检测实现对禽流感病毒的检测与分型。核酸分子生物学、蛋白质分析方面的应用Mahtab等将CdS量子点与含特定结构的核酸片断相连，结果发现能够通过量子点的表面敏化发光行为区

16、分扭结型、弯曲型和直线型等结构不同的双链DNA。Han等人利用不同颜色量子点微珠与核酸探针连接，用此方法得到的多色探针用于DNA分子杂交中，使得DNA测序技术取得了突破性发展。活体动物的标记示踪Gao等人将功能化的量子点转入Hela细胞，然后直接将该细胞注射至裸鼠的皮下，从而能够根据裸鼠皮下癌细胞荧光信号，观察癌细胞的迁移、浸润以及分化等过程。Zhang用CdHgTe量子点在近红外区对裸鼠进行了荧光成像测试，皮下注射3天后，仍然能够检测到非常明显的荧光信号。（三）其他技术1生物传感器技术生物传感器是利用生物物质作为识别元件，将生化反应转变成可定量的物理、化学信号，从而能够进行生命物质（病毒、细菌等）和化学物质检测和监控的装置。人们对以病毒的DNA或病毒蛋白作为生物传感器的检测目标技能进行了相关试验。如果完善病毒检测的相关技术，开发的这种病毒检测生物传感器将优于其他技术，其优势是样品不必进行繁琐的预先处理，适合