生化实验五大技术

1、生化实验五大技术一.分光光度技术1 .定义：根据物质对不同孩长的光线具有选择性吸收，每种物质都具有其特异的吸收光语。而建立起来的一种定t、定性分析的技术。2 .基本原理：(图1-1光吸收示意)透光度T=It/lo吸光度 A=lg(lo/I1)朗伯-比尔(lambert-Beeri)定律:A=KLcK为吸光率，L为溶液厚度(em), c为溶液浓度(mol/L)摩尔吸光系数日1摩尔浓度的溶液在厚度为I.cm的吸光度。c=A/ £3 .定量分析：标准曲线(工作曲线)法(2)对比法元-KCLCx一 Ax*CsAx KCXL CX工=-X-= J,即 CXAs KCsL Cs计算法： e=A/

2、 8(4)差示分析法(适用于浓度过浓成过稀)(5)多组分湖合物测定4 .技术分类分子吸收法&原子吸收法:可见光（400-760 nm） &紫外光（200 40m） &红外光（大于760 nm历光光度法；5 . 应用方向有机物成分分析&结构分析红外分光光度法测定人体内的微量元囊原子吸收分光光度法二电脉技术1. 定义 : 带电荷的供试品在情性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行脉动。使组分分离成族窄的区带，用透宜的检洲方法记录其电泳区带图请或计算其百分含量的方法。2. 基本原理: 球形质点的迁移率与所带电成正比，与其半径及介质粘度成反比。v

3、=Q/6xr 43. 影响电泳迁移率的因素:电场强度电场强度大，带电质点的迁移率加速溶液的PH值：溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移幸越大溶液的离子强度: 电泳液中的高子浓度增加时会引起质点迁移率的降低电渗 : 在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗4. 技术分类:自由电泳（无支持体）区带电泳（有支持体）: 法纸电泳 （常压及高压）， 博层电泳 （薄膜及薄板）. 凝波电泳（ 琼脂，琼脂糖、淀粉胶、柔丙烁配胶凝胶） 等5. 电泳分析常用方法及其特点:小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳醋酸纤维素薄膜电泳这种薄顺对蛋白质样品吸阴性小，消除纸电沫中出现

4、的“拖尾”现象分离理应快，电泳时间短样品用最少:经过冰最酸乙醉溶液或其它看明液处理后可使膜透明化有利丁对电泳图潜的光吸收措测店和爱的长期保别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测（ 胰岛素、 游菌酶、 胎儿甲种球 蛋白 ）玻脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶孔径较大，对股蛋白质不起分子筛作用琼脂糖凝胶弹性差，不适含管状电泳 用于等电液鱼、免疫电话、血清脂蛋白等蛋白质电脉，以及DNA、 RNA、 核苷酸的分析（3） 聚丙烯肤胶凝胶电泳可调节孔径大小机械强度好，有弹性分辨率高，用途广无电涉 用于不同分子量蛋白质的电泳分离 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳该种电泳使蛋白分子相对迁移率 R的大小完全取决于分子量的高低，因此

5、可从已 知分子 a 的标准蛋白的对数和相对迁移所作的标准曲线中求出供试品的分子量 最常用定性分析蛋白质的电脉方法，特别用于蛋白质纯度检测&分子 量制定等电聚焦电泳技术利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质 由于其分辨率可达0.01pH 单位，因此特别适合于分离分子相近而等电点不同的蛋白质组分。适合研究蛋白质的数观不均性毛细管电泳高灵敏度高分游率高效快速样品少成本低 符合对多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等生物大分子的分离条件三层析技术固定相: 固体物质或者是固定于固体物质上的成分;流动相: 可以流动的物质，如水和各种溶媒1 . 原理 : 当待分离的混合物队流动相通过固定相时。由于各组份的

6、理化性质有在差异，与两相发生相互作用（ 吸附、溶解。结合等） 的能力不同。在两相中的分配（ 含量对比） 不同，面口随流动相向镇移动。各组份不断地在两相中进行再分配与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。2 .技术分类按层析原理分类,名称分离原理吸附层析法组份在吸附剂表面吸附，固定相是固体吸附剂，各能力不同分配层析法各组份在流动相和静止液相（固相）中的分配系数不同离了交换层析法固定相是离子父换剂，各组份匕离于父换剂结合力不同凝胶层析法固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小/、同，因此在凝胶上受 阻滞得程度/、同亲和层析法固定相只能种待分离组份结合，以此和其无亲

7、和力的其他组份分离按操作形式不同分类名称操作形式柱层析法固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达到分离薄层层析法将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开， 使各组份分离纸层析法用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份分离薄膜层析法将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析方法进行物 质分离3 .层析法的特点与应用根据层析峰的位置及峰高或峰面积，可以定性及定量 ：析法与光学、电学或电化学仪器连用，可检测出层析后各组份的浓度或质量, 同时绘出层析图：层析仪与电子计算机联用，可使操作及数据处理自动化，大大缩短分析时间 分讲幸高、灵敏度高、选择性好、速度快适用于杂质多、含量

8、少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分高分析3. 应用方向柱层析、薄膜层析（ 以硅胶氧化铝为吸附剂） 分离 极性或极性不强的有机物离子交换层析. 分子量相对较小的球状蛋白的分离纯化纸层析 售氨基酸、糖类、联炎。抗生素的分离排阻层析 分离纯化、分析生物人分子尤其是蛋白质亲和层析法 适用于蛋白成的分离纯化气象层析氨基酸、脂肪酸、单糖、双期、固醉类物质的分离，名队。蛋白质结构的测定四、离心技术1. 定义 : 利用旋转运动的离心力，以及物质的沉障系数成浮力密度的差别进行分离，依缩和规纯的一项操作，2. 基本原理: 利用转子高速施转时所产生的强大高心力，加快颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数或浮力密

9、度差的物质分离开，1 离心力 : 2 强粒的大小形状和密度: 3 沉降介质的密度和粘度，3. 心形式 :离心过滤:在有孔转鼓的离心机中通过过滤介质分离悬浮液的过程为离心过滤离心沉降（ 或澄精）:利用固液两相比重的差异在离心机无孔转鼓或管子中进行悬浮液沉降分离者为高心沉降（ 如用于净制含少量固体的液体时也称离心清）离心分离:利用不同溶质颗粒在液体各部分分布的差异，分离不同比重液体的过程为离心分离 离心过滤。离心沉降同属固一液分离，离心分离则民液- 液分离4. 应用方向普通离心机 物质的分离&提取高速高心机 对样 品中的悬浮物质进行高纯度的分离. 浓缩、精制、提取，多用于血液、细胞、蛋白质、病毒、激素等的分离制备超速高心机 既可以 分离细胞的亚细胞器，也可以分离生物大分子五 . 酶学技术1. 牌活性 : 即酶促反应速度，指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量 ( 注 : 在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为奶2. 影响酶活性的因素: 酶浓度、底物浓度、温度、P 阳 H、 抑制剂、激话剂、时u问3. Km 值的应用鉴定酶的种炎反映酶与底物的亲合力(Km伯越大，酶与底物亲合力越小)选择酶的最适底 物计算不同底物浓度时酶促反应速度和当于最大反应速度的比率固设计适宜的底物浓度4.Vmax值的应用用