乙肝病毒特性与致病机理研究进展

1、http:/乙肝病毒特性与致病机理研究进展王晓冬，王峰，吕月蒙，李强，张国峰，孙涛，贾亚雄甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州(730070)E-mail:摘要：乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus,HBV)是引起中国及东南亚一带病毒性肝炎的主要病原之一，有半数以上 HBV 感染的患者将会发展为慢性肝炎(ChronicHepatitis,CH)、肝硬化(LiverCirrhosis,LC),甚至肝细胞性 1fl 癌(HepatocellularCarcinoma,HCC),常被形象的称之为慢性肝病三步曲”。新近有多项研究表明活化的 T 细胞反应可能在 HBV 感染的慢性化和肝细胞损伤

2、过程中起重要作用。CD4+Th 细胞可分为 Thl 和 Th2 细胞，分别介导两种不同的免疫学效应。 Thl 细胞主要分泌 IL-2,IFN-X 和肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子， 参与细胞免疫应答;Th2 细胞主要分泌 IL-4,IL-5,IL-6 和 IL-10 等细胞因子，参与体液免疫应答；Thl/Th2 的平衡决定了免疫应答的有效性和安全性。Thl 与 Th2 之间存在相互制约或促进左右，细胞因子组成一个复杂的分子网络，参与调节炎症反应以及器官功能的自我稳定。关键词：细胞因子，乙型肝炎病毒，细胞毒性 T 淋巴细胞1 .引言乙型病毒性肝炎(hepatitisB,HB)是由乙型肝炎病毒(

3、hepatitisBvirus,HBV)引起的。HBV 的感染不仅可以导致急、慢性病毒性肝炎和重性肝炎，而且还与肝硬化(livercirrhosis,LC)和肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)的发生、发展密切相关。20%的慢性乙肝患者将发展成为肝硬化，HBV 慢性感染白勺人罹患HCC 的危险性是正常人的 100 倍。HBV 感染呈世界性分布，其中西欧、北美、澳大利亚为低流行区，乙性肝炎病毒表面抗原(hepatitisBsurfaceantigen,HBsAg)携带率在 2%以下；东欧、日本、南美、北美和地中海国家为中流行区；中国、东南亚与南非为高流行区(HBsA

4、g 携带率 10%左右)。全世界共有约 3.5 亿人为 HBsAg 慢性携带者，其中 3/4在亚洲。HBV 感染导致全球每年 50120 万人死亡，其中死于 HCC 的约占 32 万。我国是 HBV 感染的高发区，约 60%的人群感染过 HBV,10%的人群为携带者，多1-4达 1.2 亿。现有乙型肝炎患者约为 1200 万，年发病率为 158/10 万。随着 HBV 疫苗在 1982 年的问世，HBV 感染率大大降低，抗病毒药物的出现也使乙型肝炎的治疗取得了一定的进展。但是，乙型肝炎的现状仍然不容乐观，现有乙型肝炎患者及带毒者数量庞大，面临发展为肝硬化和肝癌的危险，不幸的是，到目前为止，还没

5、有针对 HBV 的特效药物。因此，乙型肝炎的治疗至少在今后 50 年内仍然是一个严重的问题，寻找更有效的治疗途径是医学研究的重大课题。2 .HBV 的生物学特性2.1 HBV的生物学分类1986 年国际病毒革命委员会正式将人类 HBV 划归为一个新的病毒科一一嗜肝 DNA 病毒科(Hepadnaviridae)的成员。该科病毒成员除了人 HBV 外还有：(1)东方土拨鼠肝炎病毒(GHV),1978 年在美国新泽西州和马里兰州等地的野生土拨鼠发现该病毒。东方土拨鼠肝炎和肝癌的发病率较高；(2)地松鼠肝炎病毒(GHV),是 1980 年在美国南加州的地松鼠中发现的；(3)鸭乙型肝炎病毒(DHBV)

6、,1981 年在我国江苏省启东县肝癌高发区分离自易发生肝癌的麻鸭，后来在北京能够鸭和美国商品鸭中也发现此病毒2.2 HBV 的形态与结构1.%2http:/5-6OHBV 在动物病毒中是不寻常的，是由于在被浸染的细胞中能产生多类型的与病毒相关的颗7-9粒，电镜下观察 HBV 的提纯制品，证明有三种类型颗粒。1.小球型颗粒平均直径为 22nm,由空心病毒包膜组成，是 HBV 多余的衣壳蛋白，没有病毒核酸。无感染性，但刺激机体产生相应的抗体，具有中和病毒的作用，制备乙肝疫苗即由此种颗粒组成。(1).管型颗粒由小球型颗粒连接而成， 其长短不一。小球型颗粒和管型颗粒的产生是由于病毒颗粒包膜产量过剩。

7、小球型颗粒和管型颗粒与 Dane 颗粒的比例依不同的病程差异较大，一般撒 Dane 颗粒的 104108倍，在患者血液中的含量可高达 1013个/ml.(2).Dane 颗粒为完整的具有感染性的病毒颗粒，直径为 42nm,由包膜和核衣壳组成。核衣壳直径为 27nm,含有 HBcAg,单一分子的部分双链 DNA以及依赖 DNA 的 DNA 聚合酶。核衣壳很重要的一个功能是作为病毒基因组的保护性容器。另一独特的特征是 P 蛋白与长 DNA 链共价结合。在患者血液中的 Dane 颗粒含量为 104106个/ml.图一电子显微镜下可以观察到乙肝病毒剂不同的形态:,10大球形颗粒，小球形颗粒和管形颗粒-

8、2-http:/图二肝病毒(HBV)结构示意图109理化特性及抵抗力在氧化葩平衡梯度离心中，HBV 颗粒(42nm)的浮力为 1.22g/cm3.表面抗原颗粒(22nm)为 1.22g/cm1 病毒外膜成分含有来自宿主细胞的脂类，约占外膜干重的 30%。HBV 对理化因素有较强的抵抗力。病毒在 3032C 可存活至少 6 个月，在-20C可存活15 年。病毒浓度高时，60C 加热 10h,或 98c 加热 1min,以及乙醛或 pH2。4 处理均不能有效灭活乙肝病毒， 能够灭活 HBV 的常用方法和条件包括 121c 高压灭菌 20min,160c 干烤 1h,100c 直接煮沸 2min,以

9、及 0.5%过氧化酸，3%漂白粉溶液，5%次氯酸钠和环氧乙烷等的直接处理。HBV 的感染性并非与其抗原性和免疫原性相一致，在一些能够灭活 HBV 感染性的条一_11件下，其抗原性和免疫原性-仍可较好保留。9HBV 的基因组和蛋白组成HBV 基因组结构特殊，成不完全闭合的双链形式，负(一)链为全长基因，约含 3200 个核甘酸，而正(+)链是负链长度的 2080%,病毒颗粒内含有 DNA 聚合酶。在所有已知可感染人体而且具有独立复制能力的双链 DNA 病毒中，HBV 基因组是最小但又是最高效的。它12-14具有以下 4 个鲜明的特点：(1)不完全双链环状结构；(2)利用重叠的开放读码框(open

10、readingframeORF)编码多个蛋白质；(3)所有调控序列均位于蛋白质编码区内；(4)基因序列具有多变性。-3-http:/图三 HBV 基因组基本结构15HBV 含有 4 个 ORF,即 S 区（包括 preSI、preS2 及 S）、C 区（包括 preC 和 C）、P 区和 X一彻,.一，一一区，ORF 之间互相重叠。HBV 有 4 种转录子，共用一个 PolyA 加尾信号，长度分别为 3.5kb、2.4kb、2.1kb 和 0.7kb（图）。4 种 mRNA 合成 7 种病毒蛋白，即外膜蛋白（大、中、主蛋白）、17核壳蛋白（前 C 和 C 蛋白）、X 蛋白和 P 蛋白。外膜蛋白

11、由 S 基因区编码，包括 3 种外膜成分：主蛋白（smallprotein,Sprotein,即 HBsAg）、中蛋白（middleprotein,Mprotein,即 preS2+HBsAg）和大蛋白（largeprotein,Lprotein,即preS1+preS2+HBsAg）,主蛋白在 3 种成分中含量最高。主蛋白和中蛋白由 2.1kbmRNA 翻译而来，而大蛋白则是 2.4kbmRNA 的产物。HBV 的外膜蛋白构成病毒的外壳包裹颗粒，使病毒能够附着和侵入新的细胞。大蛋白在病毒与细胞受体的结合、病毒颗粒的包装和自细胞向外分泌的过程中发挥重要作用。此外，外膜蛋白还含有引起宿主免疫反应

12、的抗原表位，能够刺激机体产生保护性免疫应答。核壳蛋白由 HBV 基因组的 C 区编码， 存在两种形式： 核心抗原（HBcAg） 和 3 抗原 （HBeAg） .HBcAg分子量 21KD,是病毒核壳的组成成分，在病毒复制过程中负责对前基因组 RNA 包装，这是基因组复制的必备步骤。HBcAg 有较强的免疫原性，几乎所有的 HBV 感染者均产生针XHBcAg 的抗体。HBeAg 是分泌性蛋白，先由 preC+C 区编码带有信号肽的 24KD 的前体蛋白，前体蛋白进入高尔基体被蛋白酶切割后形成 16KD 成熟分子进入病人的血液中，HBeAg 可诱导机体产生相应的抗体，其功能尚不清楚。HBcAg 和

13、 HBeAg 土匀是 3.5kbmRNA 的翻译产物。P 蛋白即聚合酶（polymerasa,Pol）由 P 基因区编码，是一个含 816 个氨基酸的大蛋白，也是 3.5kbmRNA 的翻译产物。目前已经发现 P 蛋白具有 4 个功能性结构域，P 蛋白参与病毒基因组复制的全过程，每一个结构域在基因组复制过程中都发挥不同的作用。HBV 前基因组RNA 反转录过程中的几个关键步骤，包括 RNA 的包装、DNA 合成所需的引物、以 RNA 和 DNA为模板合成 DNA 以及将 RNA-DNA 杂交体中的 RNA 消化等，均涉及 P 蛋-4-http:/白的功能。由于 P 蛋白的重要性，使其成为抗病毒

14、药物的主要靶点。X 蛋白由 X 基因区编码，其转录子为 0.7kbmRNA。X 蛋白具有多种功能。它可反式激活 HBV本身的、其它病毒或细胞的调节序列，还可以激活蛋白激酶 C,从而影响细胞信号转导。病18-21毒在体内复制和传播也需要 X 蛋白的参与。2.5HBV 的复制在 HBV 的复制过程中，最突出的特点是，作为 DNA 病毒，HBV 不以 DNA 为模板进行复制，而是将DNA 转录 RNA 中间体(RNAintermediate)或称前基因组 RNA,再逆转录成 DNA 进行22复制，与逆转录病毒的复制过程类似。HBV 的复制过程有以下几个环节：(1)侵入：病毒颗粒的外膜蛋白和宿主细胞膜

15、上的受体(至今不清楚)结合，脱去外壳核心颗粒进入细胞质，进而脱去核壳，病毒 DNA 及聚合酶进入细胞核；(2)修复：HBV 聚合酶修复不完整的正链，使其与负链完全互补，形成共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)，即超螺旋结构，是病毒复制的重要标志；(3)转录：宿主 RNA 聚合酶 H 以 cccDNA 为模板，转录出长短不一的 mRAN,这些 mRNA 分子从细胞核转移到细胞质；(4)复制：mRNA 分子在细胞质内被翻译成外膜、核心、X 和聚合酶等多种蛋白。3.5kbmRNA 被成为前基因组 RNA(pregenomicRNA,pRNA),含

16、有病毒编码的全部遗传信息，既是蛋白质翻译的模板，也是 HBV 基因组复制时反转录的模板。在细胞质内，核心蛋白包裹 pRNA 和聚合酶形成新生的核心颗粒，病毒复制即在其中进行：先由病毒自身的聚合酶以pRNA 为模板，逆转录出负链 DNA,pRNA 被降解：再以负链为模板，合成正链 DNA,形成部分双链的环状 DNA,即成熟的病毒基因组；(5)循环：一小部分含有病毒基因组的核心颗粒重新进入细胞核，以维持核内一定量的cccDNA;(6)释放：大多数新形成的核心颗粒出芽到细胞质，装配好病毒的外壳，形成成熟的病毒颗粒释放到细胞外。图四 HBV 的复制过程23-5-http:/3.HBV 的致病性与免疫性

17、乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus,HBV)是引起中国及东南亚一带病毒性肝炎的主要病原之一，有半数以上 HBV 感染的患者将会发展为慢性乙型肝炎(ChronicHepatitis,CH)、肝硬化(LiverCirrhosis,LC),甚至肝细胞性 1fl 癌(HepatocellularCarcinoma,HCC),常被形象的称之“一一,2用为慢性肝病三步曲。HBV 感染后导致乙型肝炎的致病机制迄今尚未完全阐明。目前学者们一致认为乙型肝炎病人肝脏损伤并不是病毒在肝内复制的直接结果，而是机体对 HBV 表达产物的免疫导致25反应机制所致。人体被 HBV 感染后，可产生免疫应答反应：(1

18、)体液介导的免疫反应：受乙肝病毒感染后，机体可产生三种抗体，抗 HBs、抗 HBc 及抗 HBe。抗 HBs 一般在感染 HBV 后 4 周出现，对乙肝有保护作用。据报道，在医务人员中，有抗 HBs 者发生乙月 f 的不到 1%,而无抗 HBs 者有 11%发生肝炎。但抗 HBs 仅能作用于细胞外的 HBV,在预防感染上较重要，而在疾病恢复时尚需细胞免疫协同作用。抗 HBc 的出现反映了 HBV 新近感染及正在体内进行增殖，因此，它可用为 HBV 在体内复制的一个指标。抗 HBc 一般在感染后 60150 天出现，往往在症状出现前或出现不久后即存在，比抗HBs 出现要早 3187 天，由于抗

19、HBc 在疾病恢复过程中不仅不升高、反而下降，因此，认为抗 HBc与抗 HBs 不同，它与保护无关，而与病毒增殖和肝细胞损害有关。抗 Hbe 能使病26毒活力降低，可能有保护作用，但机制不一样。(2)细胞介导的免疫反应：目前认为 HBV 是非溶细胞性的，即不会增殖裂解被感染的细胞。因此，机体清除乙肝病毒主要依赖 T 细胞(Tc,T 杀伤细胞)或通过抗体介导的 K 细胞来杀伤靶细胞，将病毒释放于体液中，以后再经抗体作用。实验研究发现，凡转为慢性肝炎者，一般 T细胞数及功能较低下。因此，推测可能乙型肝炎病人 T 细胞功能强弱与临床过程的轻重和转归有关。Dudleuy 认为，当 T 细胞免疫功能正常

20、，受病毒感染的肝细胞不多时，乙肝病毒很快被细胞免疫配合体液免疫予以清除，这时，由细胞免疫所造成的急性肝细胞损伤可完全恢复。如 T 细胞免疫功能低下，免疫反应不足以完全破坏被病毒感染的肝细胞，或亦不能产生有效的抗 HBs,或即使抗 HBs 却无法作用于细胞内的病毒，持续在肝细胞内的病毒可引起免疫病理反应而导致慢性持续性肝炎。如机体对病毒完全缺乏细胞免疫反应，既不能有效地清除病毒，亦不导致免疫病理反应，结果出现 HBsAg 无症状携带症状。如果T 细胞免疫功能过强，病毒感染的细胞又过多，细胞免疫反应可迅速引起大量肝细胞坏死，临床上表现为暴发性肝炎。但上述学说尚未被完全证实，通过进一步的研究，多数人

21、认为细胞免疫和体液免疫相互配合发挥免疫作用。因此，抗体介导的 K 细胞作用已日益受到重视，并认为是杀伤靶细胞的重要免疫机制。除上述 T 细胞作用低下外，还有人认为慢性活动性肝炎的发生与 T 细胞抑制性功能低下，Tc 细胞或 K 细胞的杀伤功能过强有关，从而造成肝细胞27持续损伤。(3)自身免疫反应：HBV 感染肝细胞后，一方面可引起肝细胞表面抗原的改变，暴露出膜上的肝特异蛋白抗原，另一方面可能因 HBsAg 含有与宿主肝细胞蛋白相同的抗原，从而诱导机体产生对肝细胞膜抗原成份的自身免疫反应。通过研究，发现确有部分乙肝病人存在对 LSP的特异抗体或细胞免疫反应。一般认为，如病人在病程中出现自身免疫

22、反应，则可加强对肝细胞的损伤而发展成为慢性活动性肝炎。正常人由于 T 细胞对自身抗体系统的调控，在清除老化或破坏的肝细胞时，虽可产生自身抗-6-http:/体，但并不发生自身免疫性疾病。在慢性肝炎，特别是慢性活动性肝炎时，由于 T 细胞免疫机能缺陷，乙型肝炎抗原（包括 HBsAg,HBcAg 及 HBeAg）与宿主肝细胞表面或内部的蛋白质相互作用，形成含自身组织蛋白的抗原，具有较强的免疫原性，可引起持续的自身免疫反应；也可能由于病毒使机体免疫系统稳定性发生紊乱， 细胞免疫失去调控， 体液免疫反应亢进， 对宿主的自身组织产生抗体，发生自身组织免疫反应，引起肝细胞损伤。有研究表明，慢性活动性肝炎的

23、患者出现对肝细胞表面肝特异性脂蛋白的特异性细胞免疫反应。有人报道，根据肝炎患者肝细胞上免疫球蛋白的沉积，提示存在与 HBsAg 无关的自身免疫机理。有人认为，肝炎患者病毒性损伤可释放肝特异抗原，使宿主致敏，并使肝损伤持续28存在。因此，自身免疫反应在慢性活动性肝炎发病中具有一定的作用。（4）细胞因子介导的免疫机制：虽然 HBV 特异性 CTL 应答对 HBV 清除起着重要的作用但肝内 CTL的数目湖杀伤效应远低于能有效控制 HBV 感染的能力。如果 CTL 通过直接杀伤效应有效地清除含 HBV 的肝细胞，则多数乙肝患者有可能发生大片肝坏死及急性肝衰竭。因此，除了 CTL 应答外，其他的机制有可

24、能介导 HBV 诱发的肝损伤。体内及体外的研究显示，有些细胞因子可直接抑制 HBV 复制。通过加速 HBVmRNA 的降解抑制 HBV 的复制。有人报道，由 HBV 特异性的 CTL 产生的 IFN-Y 及 TNF-a 可通过非细胞致病效应增强 CTL 的抗病毒效应。肝内 CTL 产生 I型致炎性细胞因子，包括 IFN-Y,IL-12 等，控制肝内的病毒感染和复制。如29-31果这些细胞因子分泌的不足，则形成慢性感染。新近有多项研究表明 Th1/Th2 细胞平衡在 HBV 感染的结局中起着关键的作用。CD4+Th 细胞（CD4+辅助性 T 细胞）可分为 Thl 和 Th2 细胞，分别介导两种不

25、同的免疫学效应。Thl 细胞主要分泌 IL-2,IFN-X 和肿瘤坏死因子（TNF）等细胞因子，参与细胞免疫应答；Th2 细胞主要分泌IL-4,IL-5,IL-6 和 IL-10 等细胞因子，参与体液免疫应答；Thl/Th2 的平衡决定了免疫应答的有效性和安全性。Th1 细胞占优势，倾向于发生急性自限性感染和 HBV 清除；而 Th2 细胞占优势，倾向于发生持续的慢性 HBV 感染。活化的 Th1 优势反应可以强化充分的 HBV 特异性 CTL 反应。慢性 HBV 感染者中，HBcAg/HBeAg 特异性的 Th1/Th2 细胞平衡被打破（分泌性 HBeAg 耗竭了 Th1细胞，HBeAg 特

26、异性 Th2 细胞占优势）。体液免疫和细胞免疫反应是被不同的 Th细胞亚群所调节的：体液免疫主要由 Th2 细胞调节，细胞免疫主要由 Th1 细胞调节。Th 细胞35在鼠模型中观察到影响 HBcAg/HBeAg 特异性 Th1/Th2 细胞平衡的因素包括：抗原构成（HBcAg 对 HBeAg）;宿主 MHC 和 T 细胞识别位点；Th1 细胞和 Th2 细胞的交互调节分泌性 HBeAg 对 Th1 细胞的抑制；细胞因子体内治疗使 HBV 特异性 Th 细胞亚群反应向 Th1 或 Th2 倾斜。a 干扰素能诱导 IL-1232 亚单位的表达，可以使 Th0 细胞向 Th1 细胞分化，这是 a 干

27、扰素调节Th1/Th2 细胞平衡的分子机制之一。最新的研究认为,CTL 在不损伤肝细胞的情况下也可能清除 HBVDNA、核壳蛋白和 DNA复制中间体，即非溶细胞性清除机制这种作用是通过 Th1 型细胞因子诱导而实现的，慢性乙型肝炎的恢复伴随着 Th1 型细胞因子反应上调，在病毒清除时汗扰素水平有显著升高。在黑猩猩中也发现HBVDNA 水平的下降伴随着汗扰素的增加。在 a 干扰素抗病毒治疗显现持续反应者中，肝内 HBV 特异性 CD4+T 细胞反应和 Th1 型细胞因子显著增加存在相关性，外亚群失衡将严重扰乱体液免疫和细胞免疫32-34O周血淋巴细胞中细胞因子的表达也以 Th1 型占优势，这说明

28、胃扰素的抗病毒效应在很大-7-http:/4.乙型肝炎的抗病毒治疗和特异性免疫重建乙型肝炎治疗的目的是减轻肝脏病变，防止或延缓发展为肝硬化、肝癌，最终目标是彻底清除病毒，达到完全治愈。除一般的保护肝脏和免疫调节治疗外，抗病毒治疗是肝炎治疗的重点也是难点。到目前为止，获得美国食品与药物管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)批准并在临床应用的抗HBV 药物有两大类：干扰素及核昔类似物，它们的代表药物分别是 a 干扰素一一一_、39(interferon-a,IFN-a)，拉米夫TE(Lamivudine,3CT)。a干扰素“干扰素本身是机体细胞因子网络中的重要组成部分

29、，具有抗病毒、抗细胞增殖和免疫调节等多种生物活性。40-41a干扰素的免疫调节作用包括以下几个方面：(1)调整 Th1/Th2 细胞平衡，促进 Th1 优势反应；(2)使 CD4/CD8 比值恢复正常；激活 NK 细胞的细胞毒作用，增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)活性；(3)能诱导病毒感染细胞表面主要组织相容复合体(MHC)-I 类抗原表达，有利于 CTL 对感染细胞的识别和攻击；(4)能激活抗原提呈细胞，增强抗原提呈细胞的功能；(5)能增强巨噬细胞的吞噬功能，诱导释放溶酶体酶；(6)调节细胞因子，如 IL-1、IL-2、TNF、有丝分裂因子、巨噬细胞激活因子等的分泌，参与免疫增强反

30、应。拉米夫定拉米夫定抑制 HBVDNA 复制迅速、疗效确切。但拉米夫定的免疫调节作用并未得到肯定。早年的一项研究认为，拉米夫定可以使血清 HBVDNA 迅速下降，但不能重新恢复受损的 HBV 特异性 T 细胞反应。最近的研究认为，拉米夫定可以重建 HBV 特异性细胞免疫在拉米夫定治疗过程中测定 T 细胞功能时发现，拉米夫定在大幅度降低病毒和抗原数量的同时，可使长期处于对 HBV 低反应状态的 T 细胞功能得以恢复。在一组 HBeAg 阳性、ALT 升高单独应用拉米夫定的病例中，观察到拉米夫定可以克服慢性 HBV 感染状态时 CTL 低应答状态，使 CTL 对外源性刺激敏感。在拉米夫定治疗后71

31、4 天，可以测得明显的 CD4+T 细胞介导的对 HBV 核壳抗原的反应，这种反应在 12 例患者中有10 例呈持续性，其出现继之以快速且显著的血清病毒水平的下降。伴随着血清病毒水平的下降，拉米夫定治疗后慢性乙型肝炎患者有效的抗病毒 T 细胞反应可以得到恢复和重建；拉米夫定还可增强 T 细胞对丝裂原和回忆抗原的反应，说明拉米夫定的效【物应并不局限于 HBV 特异性 T 细胞。一般认为 a 干扰素和拉米夫定治疗显效的近期均不能清除细胞内 HBVCCCDNA,停药后部分病例容易复发，这些复发病例很可能没有建立起充分的抗病毒免疫反应。当充分正规的治程度上是通过 Th1 型细胞因子而实现的36-384

32、3疗使抗病毒免疫反应稳固重建后，细胞内 HBVcccDNA 也许可以清除。近年来核昔类药物的研发在国际上很活跃，随着抗病毒药物的逐渐增多，药物的联合-8-http:/应用为提高疗效和降低耐药提供了可能。.乙型肝炎的基因治疗所谓乙型肝炎的基因治疗是指将正常的野生型基因或特定设计的治疗基因导入机体或特定的细胞内替代、修正、补偿有缺陷的基因功能；或封闭、抑制异常表达的基因以达到治疗某种疾病的目的。目前乙型肝炎基因治疗的主要策略包括：反义技术、反基因技术、核酶、DNA 疫苗、干扰性多肽或蛋白质以及单链抗体等。反义技术反义技术是指设计与 mRNA 序列互补的核酸分子，导入细胞，使其遵循碱基配对原则与 m

33、RNA特异性位点结合，从而抑制或阻止蛋白质的翻译，达到抗病毒的目的。反义技术有反义寡聚核糖核甘酸(antisenseoligodexynucleotide,ASODN)和反义 RNA(antisenseRNA)。ASODN 是人工合成的由1230个碱基组成的与靶mRNA互补的寡核甘酸片段。 它的作用机制包括以下几个方面：ASODN 与靶 mRNA 结合，形成 DNA-RNA 杂化分子，阻止蛋白质的翻译，并诱导 RNaseH 降解靶 mRNA;(2)作用于 mRNA5,端，阻止帽子结构的形成，影响 mRNA 的成熟；(3)作用于 polyA 的形成位点，阻止 mRNA 的成熟及向胞浆内转移。由于

34、 ASODN 在细胞或体内易被核酸降解失活，为增强其稳定性提高抑制作用，需要对 ASODN 进行修饰。现常用的修饰方法包括硫代磷酸化和甲基化，亦有报道用聚乙二胺与 ASODN 结合可阻止在体内降解。经过修饰后的 ASODN 在透膜性和稳定方面都有很大提高。体外研究表明，针对 HBVS、C、P、X 区基因的 ASODN 均取得相应的抑制效果。反义 RNA 在细胞质内与基因的 mRNA 完全互补，从而阻止蛋白质的翻译。反基因技术与反义技术不同，反基因技术是根据三螺旋结构 DNA 形成的原理，以靶基因中同聚喋吟-喀咤区域为靶位点，设计、合成反基因寡核甘酸或三螺旋形成寡核甘酸，导入细胞内，通过与双链D

35、NA 形成三螺旋结构，抑制或阻断靶基因的转录。核酶(Ribozyme,Rz)核酶(Ribozyme,Rz)是一种具有核酸内切酶活性的 RNA 分子，可特异性地与靶基因结合并切割靶mRNA。近年来，应用 Rz 已成功地在细胞内抑制 HBV 的基因表达。最近，一种针对 HBVmRNA 的经化学修饰的 Rz 已经进入临床试验阶段。DAN 疫苗(DNAvaccine)DAN 疫苗(DNAvaccine)又称基因疫苗或核酸疫苗，是指将编码某一特定蛋白质抗原的基因片段插入适当的真核细胞表达载体中，构建重组质粒，然后经肌肉注射或基因枪技术直接接种到机体中，宿主细胞摄取质粒后，表达抗原蛋白，从而诱导机体产生特

36、异性细胞免疫和体液免疫应答。针对 HBV 的基因疫苗一般选择 HBVC 区和 S 区为靶点构建质粒， 诱导机体产生特异性细胞免疫和体液免疫应答， 达到清除病毒的目的。目前已有一批针对 HIV、HBV 及流感病毒的预防及治疗型 DNA 疫苗正在进行临床试验。http:/负性突变体技术负性突变体技术是通过构建病毒蛋白编码基因的突变体，在细胞内表达异常的病毒蛋白或多肽，从而干扰病毒核酸的包装及病毒颗粒的装配。单链抗体技术单链抗体技术是将目的抗体基因转导靶细胞并产生抗体，中和病原体并抑制其复制的一种治疗方法。有研究表明，HBsAg 的单链抗体(singlechainvariablefragments,

37、scFv)可使细胞外的 HBsAg 降低 85%。选择抗 HBcAg 的单链抗体基因在细胞内表达 scFv,通过在细胞内形成44-46抗原-抗体复合物和干扰 HBcAg 的功能可抑制病毒复制。.常见的几种 HBV 病毒变异S 基因区变异S 基因区包括前 S1、前 S2 及 S 基因，分别编码前 S1 蛋白、前 S2 蛋白及主蛋白。HBVDNA 第 3055核甘酸(nt)约相当于前 S1 起始码下游第 230 碱基，可突变形成终止码，并影响前 S2 起始码，这种突变与 HBV 逃避干扰素治疗和宿主免疫清除有关。HBVDNA 第 2995-3177nt 位于前 S 开放读码框(ORF)内，但其缺失

38、可削弱前 S 的免疫性，但仍能保留与肝细胞的结合位点，有利47于 HBV 逃避机体的免疫攻击，形成慢性携带状态。在某些病人，HBsAg 虽然转阴，但肝功能仍未恢复，有相当比例 HBsAg(-)、抗 HBs(+/-)的患者体内仍可检出 HBVDNA,可能原因有：HBsAg 滴度低，常规方法不能检出；HBsAg 隐匿于 HBsAg/抗 HBs 复合物中；病毒整合后 S 基因替代突变、缺失或重排；HBV 变异株产生改变了 HBsAg 的抗原反应性，使病毒发生诊断逃避临床上出现的 HBsAg(+)母亲所生婴儿用乙肝疫苗免疫失败者和原位肝移植受者免疫预防再感染失败者中，大多出现了 S 基因区变异，从而形

39、成免疫逃避和疫苗逃避在用高效价乙肝免疫球蛋白(HBIG)预防 HBV 再感染的原位肝移植受者体内检出的 S 突变株，特别是第142,l44,145aa 三处，包括典型的疫苗逃避株145 氨酸-精氨酸。这些突变可削弱或改变 HBsAg 的免疫原性，降低 HBsAg 被 HBIG 识别的能力；撤除 HBIG 后又可回复到野生型，高度提示这些突变是长期免疫压力筛选的结果。因而有学者不赞同乙肝孕妇在怀孕第 7、8、9月注射 HBIG 以减低新生儿感染率，他们认为这样反而会因过度使用 HBIG 而导致病毒变异而使阻断失效。但这样的报道尚未有有力数据支持。前 C 心基因变异，C1896 位(A83)的变异

40、：前 C/C 基因变异，C1896 位(A83)的变异是 HBV 中最常见的变异。野毒株 1896 位是 G,变异为 A,A83氨基酸(TGC)变异为终止密码(TAG),使前 C 蛋白的翻译终止， 从而使 eAg 不能合成， 此突变有助于 HBV逃避免疫攻击但它并不影响报道复制，而形成慢性感染状态。这种情况临床上表现为 HBeAg(-)、HBV-DNA(+),而病人仍处于活动状态的慢性乙型肝炎。即未经药物治疗的小三阳但 HBV-DNA 阳性者。上述变异也见于干扰素治疗后，因此提示以 HBeAg 转_一48阴作为疾病好转的指标有时并不准确，结合 HBV-DNA 检测判断。P 基因区变异-10-h

41、ttp:/P 基因区编码 HBVDNA 聚合酶(DNAP),其自然突变率与逆转录病毒 gag 基因相近。第 2798ntAfC 可使DNAP 中的一个脯氨酸由苏氨酸取代，导致 HBV 复制缺陷。目前临床上广泛使用的胞昔类似物拉咪味咤(1amivudine)和乌昔类似物泛昔洛韦(famciclovir)等抗 HBV 药物，作用靶位主要是 DNAP,通过与底物 dNTP 竞争结合以抑制 HBV 的逆转录和复制。但这些药物的使用产生了 HBV 的耐药突变株，而形成了抗病毒治疗逃避”。HBV 耐药株的突变就发生在DNAP 基因内。DNAP 催化中心核甘酸结合位区为一高度保守序列，即酪氨酰(Y)、蛋氨酰

42、(M)、天冬氨酰(D)基序(YMDDmotif),是 DNAP 发挥催化活性所必需的关键结构。发生突变以后可能使已降低的病情加剧(即所谓反跳)，对所用药物产生耐受。YMDD 耐药变异的防治：随着用药时间的延长，核甘类药物易引起病毒变异，导致耐药。为了减少耐药性的出现，可以联合用药。从理论上讲，干扰素和核甘类药物在不同的靶位点联合应用，可减少耐药株的出现。阿德福韦是一个广谱的抗病毒药物。在 HIV 治疗过程中未发现有耐药变异。49所有变异株对阿德福韦均敏感，且对联合变异也有效。6.4X 基因区变异X 基因是病毒复制的重要调节区，是转录、反转录和正链合成的起点，也是多种细胞因子结合点，此区变异影响

43、到病毒的转录和复制。目前认为 X 基因区 BCP、SP 或 PreSP 的变异改变了 HBV 基因表达的平衡， 与 HBV 持续感染相关。 这种变异株的 HBsAg,HBcAg,HbeAg 表达水平均下降，但 DNA 水平与野生株相仿或稍高，提示病毒复制能力变化不大；将后一变异株与少量完整的 X 基因共转染细胞，则 HBcAg 产量比单纯变异株多 3 倍。但 Cabrerizo 等报道 HBVORF-X 变异可能也是某些患者体内 HBVDNA 水平较低、 病毒生物活性减弱的一个原因。 HBxAg 也可能成为致敏 CTL 攻击的靶抗原。患者血清中可溶性 HBxAg 相关多肽可调节CTL 对靶细胞

44、的免疫识别，因此 ORF-X 变异可能亦不利于清除 HBV。另一方面，HBxAg 是_、一.,一一50一种强力反式激活因子，可通过多种途径促发肝细胞癌变。7.乙型肝炎研究的细胞模型建立表达乙型肝炎病毒的体外培养细胞模型，对研究 HBV 生物学特性、乙型肝炎发病机制、体外抗 HBV 药物筛选及致癌机制的研究有重要意义。肝源细胞系肝脏是 HBV 感染和复制的主要场所，故肝细胞是 HBV 感染模型的首选细胞。目前应用于 HBV 培养的细胞系有成人肝细胞系、胚胎肝细胞系和肝癌细胞系，尤其是肝癌细胞系，如HepG2,Huh6-C15,Huh-7,Hep3B,PLC/PRE/5 等，在 HBVDNA 及其

45、基因组片段的转染细胞系的建立中占有重要的地位。(1)成人肝细胞模型： 用含 HBV 感染颗粒的人血清接种培养的成人肝细胞， 可在上清中检测到 HBV抗原和 HBVDNA,表明 HBV 可感染原代培养的成人肝细胞，同时用 preS1 特异性抗血清能阻断病毒感染。川在含 2%二甲亚矶(DMSO)培养液中加入聚乙二醉可显著增强HBVDNA 内吞量和提高病毒的吸附效率而不改变 HBV 感染的组织及种属特异性。HBV 感染成人肝细胞模型与自然感染过程相似，病毒抗原可较长时间存在，细胞内出现 HBVDNA 复制型.但成人肝细胞是一类终末分化的细胞，不能传代培养，且在肝细胞铺板后，成熟肝细胞的功能如白蛋白产

46、生能力下降、失去典型多角形态，对病毒敏感性也逐渐下降，限制其实际应用。-11-http:/(2)胚胎肝细胞模型：人胎肝细胞系可较好模拟人体内肝细胞的生物学功能，并对血清 HBV感染敏感，产生 HBV 复制型和各种病毒标志物，释放 Dane 颗粒。来自不同胎龄的胎肝细胞HBV 感染显示相同的感染动力学。 但成熟的原代胎肝细胞体外长期培养非常困难， 细胞分化能力有限，不能多次传代，且胎肝细胞的分化状态对病毒复制可能产生影响，限制了其应用和研究。HepaRG 细胞株：由于用血清直接感染细胞更接近自然感染状态，适用于研究在自然条件下病毒吸附、穿入宿主细胞的机制，及抗体的中和作用、抗病毒治疗等，而过去所

47、建立的肝癌细胞株无法直接用病人血清感染。PhilippeGiipon 等 1121 从慢性丙型肝炎感染的肝癌病人体内分离，加入 DMSO 和类皮质激素培养，建立的 HepaRG 肝癌细胞株。HepaRG 细胞株与正常的肝细胞相比具有相似的形态学和生理学功能，既可用于转染，又和原代肝细胞一样适合于 HBV 血清直接感染，从培养上清中可检测到 HBV 抗原和 HBVDNA.而且该细胞株具有与正常人肝细胞相似的生物学特性，可以应用于研究病毒感染的早期阶段包括仍然未知的病毒分子受体、药物对病毒感染早期阶段的作用、抗病毒药物的筛选、药物的毒理学和药理学在内的许多领域。非肝源细胞系1980 年以来，陆续在

48、肝外组织如胰腺、肾脏、骨髓淋巴样母细胞和外周血单个核细胞等中发现了HBVDNA 及其基因产物， 并且可作为 HBV 感染复发的重要来源， 提示 HBV 除了肝细胞外， 还有泛嗜性，这是将非肝源细胞列入转染靶细胞的重要依据。目前用于 HBVDNA转染的非肝源性细胞系有：FL5-1,Hela 细胞、单个核细胞系 U937 细胞、树突状细胞等。这些细胞系可表达病毒的全部或部分抗原、HBVDNA,表明其内环境可支持 HBV 复制、包装和分泌。HBV 基因在 U937 和树突状细胞中成功表达对研究 HBV 复制机理、在骨髓来源的细胞系中的调节、免疫系统对 HBV 的影响等十分有用。但非肝脏细胞装配和分泌

49、的 HBV 颗粒，只是类似于天然状态的 HBV 病毒颗粒，与真正天然状态的 HBV 颗粒有很大差别。动物细胞系许多研究表明，HBV 可在动物细胞系中获得短暂或较长时间的表达。DeMeyer 创 414 研究表明 HBVS 基因表达的小蛋白(SP)能与 Ca+依赖性磷脂结合蛋白(humanannexinV)特异性结合，促进 HBV 进入大鼠原代肝细胞复制并进行表达，介导 HBV 跨种属特异性感染。在动物细胞系中的成功转染表明 HBV 感染的种属屏障在于其对靶细胞细胞膜的吸附及透过，而HBV 的复制和表达则依赖于肝细胞内环境。此外，小鼠成纤维细胞系 NIH3T3 和 LtK、大鼠Morris 肝癌

50、细胞系 Q7、果蝇细胞、非洲绿猴肾细胞 Vero 等，也常被选为转染靶细胞，可表达 HBV 的抗原和分泌病毒颗粒。HBV 在非人类细胞内复制的细胞模型可作为在人类细胞内复51-52制模型的补充。展望HBV 细胞模型是筛选抗 HBV 药物、研究 HBV 生物学特点及其与细胞间相互作用的必要工具。己有的细胞模型在研究 HBV 发病机理、免疫机制、抗病毒药物的筛选中发挥了一定的作用，但也存在问题：(1)无对病毒感染和致癌机理合适的细胞模型；-12-http:/(2)细胞表达的稳定性问题。今后建立的细胞模型应借助于分子生物学、分子细胞学的最新进展，寻找既适用于转染，又可用血清直接感染，接近肝细胞生理状

51、态并能稳定表达HBV 抗原的细胞模型，将对研究 HBV 的生物学特性、感染姆制、抗病毒药物的筛选和致癌机制有重要帮助。参考文献1.姚光弼等，临床肝脏病学，上海科学技术出版社.Young-SukLim,DongJinSuh.CurrentAntiviralTherapyforChronicHepatitisB.JKoreanMedSci.2004;19:489-494.病毒性肝炎防治方案.中华传染病杂志，2001,19:5662.谢天恩胡志红普通病毒学，科学出版社，2002.KozielMJ.Cytokinesinviralhepatitis.SeminLiverDis,1999,19:157-

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