食品中铜绿假单胞菌检测

1、.铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌.一、概 述 铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）俗称绿脓杆菌，因为在代谢过程中产生水溶性的绿色色素，使伤口与创面呈绿色，故名绿脓杆菌。 铜绿假单胞菌能在许多污染物质中存活并繁殖，生长营养需求不高，善于利用各种碳源和氨化合物作为氮源，在水、土壤、食品以及医院等环境广泛存在，甚至在蒸馏水、消毒液也不例外，如季铵类消毒液，特别是含有一些有机物的液体。 . 铜绿假单胞菌可由多种途径传播，但主要是通过污染医疗器械、用具及带菌医护人员引起医源性感染，因此，对烧伤病房、手术器械及治疗器械应进行严格消毒灭菌，以保证无铜绿假单胞菌的污染。对铜绿假单胞菌感染的治疗，可应用庆大霉素

2、、多粘菌素B和羧苄青霉素。 铜绿假单胞菌抵抗力较其他革兰阴性菌强，561h可杀灭，对很多抗生素具有耐受性。对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素及不良环境抵抗 力强，对化学药物的抵抗力比一般革兰氏阴性菌强大。 .二、生物学特性1. 培养特性 本菌属于假单胞菌属，是一种 非发酵革兰阴性无芽孢杆菌，菌体 细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或 短链状排列。菌体的一端有单鞭毛，在暗视野显 微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼。2菌体形态 无芽孢，无夹膜，革兰阴性杆菌，有单鞭毛或丛鞭毛，运动活泼。菌体的大小为0.51m1.53.0m，菌体笔直或弯曲。.3、生化特性 氧化酶和过氧化氢酶阳性。O/F试验为

3、氧化型，还原硝酸盐为亚硝酸盐，分解乙酰胺产生氨。 98 菌株产生水溶性荧光色素。铜绿假单胞菌能液化明胶，酪蛋白水解，但淀粉不水解。90 以上的菌株产生蓝绿色色素。 分解蛋白质能力强，发酵糖类能力较低，氧化分解葡萄糖，产酸不产气，不分解甘露醇、乳糖及蔗糖，能液化明胶，分解尿素，不形吲哚，氧化酶试验阳性，还原硝酸盐产气，靛基质阴性，不产硫化氢。.三、致病性 主要致病物质是内毒素，此外尚有菌毛、荚膜、胞外酶和外毒素等多种致病因子。可引起局部化脓性炎症，也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃肠炎、心内膜炎 、脓胸，还可引起菌血症、败血症及引起婴儿严重的流行性腹泻。 WHO的HACCP评估明确指出铜绿假单胞

4、菌是婴儿瓶装饮用水的危害指示菌，可造成婴儿腹泻。尤其是抵抗力较差的老弱病幼孕人群，饮用含铜绿假单胞菌的瓶装水很可能导致疾病的发生，患者食入103104个菌体细胞即可被侵害。铜绿假单胞菌的生长还将增加亚硝酸盐的含量-参考文献。. 国内外污染情况- 参考文献 国内污染情况： -瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率1.223.6； -瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率11.6。 国外污染情况： -Richards等在104件检品中的4件分离到铜绿假单胞菌； -Rosenberg报告德国1.210.2的瓶装矿泉水检出铜 绿假单胞菌。 刚出厂的产品中铜绿假单胞菌数量较少，但有文献报 道5加仑桶装产品（15

5、31天的保存期），铜绿假单胞 菌可生长繁殖达到 CFU/ml。 国内卫生标准：0 CFU/250ml.三、实验室检验 GB/T 8538-2008铜绿假单胞菌检测（滤膜法）.原 理 将250mL水样用孔径为0.45m的滤膜过滤，并将滤膜移至CN琼脂培养基上，于36士1恒温箱中培养48h，能够在CN琼脂上生长并产生绿脓菌素，或者能够在CN琼脂上生长并且氧化酶呈阳性、紫外光（36020nm）照射下能发荧光、能够利用乙酰胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌，经证实为铜绿假单胞菌，则其检测结果为阳性。.培养基和试剂 假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂（低温避光保存） 金氏B 培养基（低温避光保存） 乙酰胺肉汤

6、营养琼脂 氧化酶试剂 钠氏试剂（配制好之后低温避光保存）. 设备和仪器 玻璃器具：所有玻璃器皿使用前需121高压蒸汽灭菌15分钟 恒温培养箱：361 紫外灯：波长应为36020nm 滤膜：直径47mm，微孔径为0.45 （处理方法：如滤膜未经灭菌，则使用前需先将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次，每次15 min。前两次煮沸后需更换水，用蒸馏水洗涤2次3次，以除去残留溶剂。建议使用一次性无菌滤膜。） 显微镜：10100 冰箱：08.操作步骤-水样过滤 在100级的洁净工作台进行过滤操作。 首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分， 将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上， 固定好滤器，

7、将250mL水样或稀释液通 过孔径0.45m的滤膜过滤，然后将过滤 后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上， 平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着 气泡。.结果观察 培养20h24h观察滤膜上菌落的生长情况并计数，防止因为培养导致菌落过分生长而出现菌落融合。（ 40h48h时更容易观察产色素情况和荧光情况）。.可疑菌落计数情况 计数所有显蓝色或绿色（绿脓色素）的菌落，初步判定为铜绿假单胞菌。 计数滤膜上所有发荧光不产绿脓色素疑似铜绿假单胞菌菌落，并进行乙酰胺肉汤确定试验。（在紫外线下检查滤膜时，应避免长时间在紫外光下照射，否则可能会将平板上的菌落杀灭，而导致无法在证实培养基上生长。） 将其它所有红

8、褐色不发荧光的菌落进行氧化酶试验、乙酰胺肉汤、金氏B培养基确证实验。.纯 化 营养琼脂：将需验证的可疑菌落划线接 种营养琼脂培养基，于361培养 20h24h，对可疑菌进行纯化。. 将最初显红褐色的菌落进行氧化酶试验 氧化酶试验 ： 原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。 操作：取23滴新鲜配制的氧化酶试剂滴到放于平皿里的洁净滤纸上。用铂金丝接种环或玻璃棒，将适量的纯种培养物涂布在预备好的滤纸上。在10秒内显深蓝紫色的视为阳性反应。也可以按照商品化氧化酶测试产品的说明书进

9、行该项测试。.产氨实验（乙酰胺肉汤） 原理：铜绿假单胞菌产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，滴加钠氏试剂（碘化汞钾），氨在碱性条件下与碘化汞钾作用，生成红色的络合物。 操作：将纯培养物接种到装有乙酰胺肉汤的试管中，在361下培养20h24h。然后向每支试管培养物加入12滴钠氏试剂，检查各试管的产氨情况，如表现出从深黄色到砖红色的颜色变化，则为阳性结果，否则为阴性。.产荧光素实验（金氏B培养基） 原理：蛋白胨提供氮源，磷酸盐促进荧光素的产生并抑制绿脓色素的产生，硫酸镁为荧光素的产生提供必须的阳离子，琼脂是培养基的凝固。 操作：将上述呈红褐色的且氧化酶反应呈阳性的培养物接种于金氏B培养

10、基上，于361恒温箱培养24h5d。 每天需取出在紫外灯下检查其是否产生荧光性，将5d内产生荧光的菌落记录为阳性。.计数结果说明 菌落计数公式：NPF(cF/nF)R(cR/nR) P是呈蓝/绿色的菌落数（所有证实为铜绿假单胞菌的菌落）。 F是没有绿脓色素但显荧光的菌落数。 R是呈红褐色的菌落数。 nF是进行产氨测试的显荧光菌落数。 cF是产氨阳性的显荧光菌落数。 nR是进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试的红褐色菌落数。 cR是产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试均呈阳性的红褐色菌落数。. 举 例 N=17+16(2/5)+10(3/5) 17：呈蓝/绿色的菌落数； 16：没有绿脓色素但显荧光的菌落数； 2：产氨阳性的显荧光菌落数； 5：进行产氨测试的显荧光菌落数； 10：呈红褐色的菌落数； 3：产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试均呈阳性的红褐色菌落数； 5：进行产氨、氧化酶、金氏B培