超抗原SEB活化耐受性NKT细胞亚群的研究

1、超抗原SEB活化耐受性NKT细胞亚群的研究 11-01-30 11:29:00 编辑：studa20 作者：陈钰, 钟江 徐健, 陈中才, 郭业磊, 金婷, 张继慧【摘要】 目的: 探讨超抗原SEB活化的效应细胞参与免疫耐受的NKT细胞亚群及分化特征。方法: 采用C57BL/J小鼠脾细胞经SEB诱导, 收集体外扩增10 d的淋巴细胞为效应细胞, 与刀豆蛋白（ConA）、 脂多糖（LPS）和白介素2（IL2）共同培养3 d, 测定效应细胞对刺激剂的应答反应能力。在正常小鼠淋巴细胞与上述刺激剂反应的同时添加效应细胞, 3 d后测定效应细胞抑制正常淋巴细胞对刺激原的应答反应能力。用MTT染色方法记录

2、细胞增殖的A值。以ConA活化的淋巴细胞做参照, 用流式细胞术(FCM)解析了耐受性效应细胞中NKT细胞亚群并显示分化来源与功能的相关性。结果: 与正常淋巴细胞对抗原应答反应能力相比, SEB活化的效应细胞对ConA、 LPS和IL2【关键词】 NKT细胞亚群; 超抗原; SEB; 免疫耐受 NKT细胞是以NK细胞和T细胞两者为特征的, 仅占淋巴细胞群的1%1。NKT细胞的作用主要有两个方面, 效应功能和调节功能。它可以抑制Th1细胞的过激, 控制IL2, IFN的产生和后期的细胞增殖, 可以调节Th2细胞的细胞因子产生, 使T细胞分化朝Th2方向偏移; 它也可以在Th1细胞抵抗感染和肿瘤时提

3、供帮助以及可以阻止部分细胞的分化, 控制自身免疫病的发生和发展2。越来越多的研究报道了NKT细胞有很多亚群3, 4, 但是仍不能区别不同亚群的不同功能以及它们的来源和分化途径。我们以往的研究发现超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B（Staphylococcal enterotoxin B, SEB）能诱导外周淋巴细胞生成效应细胞, 这些效应细胞具有明显的抗排斥作用和免疫耐受特征, 并且均伴随NKT细胞的增加5, 6。本研究用超抗原SEB在体外扩增了具有耐受功能的效应细胞, 对这些细胞的耐受调节特征、 细胞亚群以及在外周淋巴系统生成的NKT细胞的分化途径进行了研究。 1 材料和方法 1.1 材料 C57

4、BL/J小鼠（雌性, 质量1820 g, 68周龄）来自解放军第301医院实验动物中心二级动物房。RPMI1640培养基购自Gibco公司, MTT染料（四甲基偶氮唑盐3（4.5dimethyiazolzyl）2.5diphenyl tetrazolium bromide）、 ConA和LPS均购自Sigma公司, 二甲基亚砜(DMSO)购自Solarbio 公司, 胎牛血清购自北京军区兽医防治中心, IL2由解放军302医院病毒研究所惠赠; SEB（自主知识产权, 专利号: 00103991.4）; 抗CD3PerCP、 CD4FITC、 CD8PE、 NK1.1APC和抗TcRV8PE荧光

5、抗体均购自BD公司。 12 方法 121 正常小鼠淋巴细胞制备 摘取C57BL/J小鼠脾细胞在无菌台前分离细胞, 用含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液制成细胞悬液, 经红细胞裂解, 洗涤2次后, 制备成密度为5109/L个细胞的悬浮液待用。 122 SEB活化的耐受性效应细胞制备 在25 mL培养瓶中加入1109细胞/L, 随后加入3.5 mL 400 g/L SEB混合后置37、 50 mL/L CO2孵箱培养5 d。洗涤换液后细胞继续培养到第10天, 收获细胞, 作为耐受细胞悬浮至5109细胞/L用于抑制功能实验。 123 SEB活化的耐受性效应细胞对刺激剂的应答反应 在9

6、6孔板中加入5105细胞/(100 L/孔), 并分别加入0.1 mL ConA(10 mg/L), 0.1 mL LPS(10 mg/L)和0.1 mL IL2（200 IU/mL）, 对照组加入培养液。在37、 50 mL/L CO2孵箱培养3 d后MTT染色, 570 nm波长下测定细胞增殖的A值。 124 SEB活化的耐受性效应细胞抑制功能的测定 在96孔板中加入正常C57BL/J小鼠脾细胞5105细胞/（100 L/孔）, 并在分别加入0.1 mL ConA(10 mg/L), 0.1 mL LPS(10 mg/L)和0.1 mL IL2（200 IU/mL）的同时加入SEB活化的效

7、应细胞5105细胞/（100 L/孔）。对照组为正常淋巴细胞分别加入上述相应刺激原。在37、 50 mL/L CO2孵箱培养3 d后MTT染色, 570 nm波长下测定细胞增殖的A值。 125 SEB活化耐受性效应细胞的T细胞和NKT细胞亚群解析 实验分为SEB和ConA两个组。在96孔板中加入5105细胞/（100 L/孔）, 并分别加入0.1 mL SEB(400 g/L)和0.1 mL ConA(10 mg/L), 在37、 50 mL/L CO2孵箱中培养。取培养第10天的细胞经抗CD3PerCP、 CD4FITC、 CD8PE和NK1.1APC以及CD3PerCP、 CD4FITC、

8、 NK1.1APC和TcRV8PE荧光抗体四染色后, 用流式细胞仪（FACs Calibue BD, USA）测定T细胞、 NKT细胞亚群增殖的百分数并记录NKT细胞亚群分化途径。 126 统计学分析 计量资料用xs表示。采用t检验分析。所有数据均用CHISS统计软件处理。 2 结果 图1 SEB 活化的效应细胞对刺激剂的应答反应 Fig 1 The response of the effecter cells by SEBactivated to several mitogens eff.cells: The effector cells by SEBactivated. bP0.01 vs

9、 control group. 23 SEB或ConA活化T淋巴细胞亚群的比较 在SEB活化的具有耐受功能的效应细胞中CD3+、 CD4+ T细胞亚群百分数分别由原始的27.52%和15.04%下降至18.74%和12.35%(P0.05）, TcRV8+T细胞从10.55%上升到28.48%（P0.01, n=4）。ConA活化的淋巴细胞主要是T淋巴细胞, 包括CD3+、 CD4+、 CD8+和TcRV 8+T细胞亚群。它们分别由最初的27.52%、 15.04%、 16.11%和10.55%上升到41.72%、 36.49%、 54.21%及25.86%（P0.01, n=4, 表1)。表

10、1 SEB或ConA活化的T细胞亚群百分数 24 SEB和ConA活化的NKT细胞亚群的比较 在SEB活化的耐受性效应细胞中, 明显增殖的细胞是CD4+ NK1.1+、 CD8+ NK1.1+ 和TcRV8+ NK1.1+ 的NKT细胞亚群, 它们分别由原始的0.86%、 1.72%和0.92 %上升至9.53%、 7.02%和3.34%(P0.05, P0.01, n=4); CD4-CD8-CD3+ NK1.1+NKT细胞没有显著性增加。相反ConA活化了CD4-CD8-CD3+ NK1.1+NKT细胞, 使这群细胞的百分数由原始的1.51%上升至2.81%（P0.05, n=4）, 但不能诱导其他NKT细胞亚群活化增殖（表2）。表2 SEB或ConA活化的T细胞亚群百分数 25