农杆菌的活化培养及介导的遗传转化

1、一、目的要求通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。二、基本原理农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、茎段等共同培养的一种转化方法（图61）三、材料及方法1含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。2植物幼苗。（一）细菌培养液直接浸染法操作：（1）无菌受体材料的准备：叶片、茎段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。 取自无菌试管苗。 取自田间或温室栽培植株：叶片、茎尖、茎段用蒸馏水冲冼1 遍后，

2、70乙醇洗45 秒，0.1升汞消毒68 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。（2）受体材料预培养：将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，无菌胚轴、茎切成约0.81cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下：预培养23 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。（3）农杆菌培养： 从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27, 180r/ min 培养至OD600 为0.60.8。 取OD600 为0.60.8 的菌液，按12的比例，转入新配制的无抗

3、生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD600为0.20.5 时即可用于转化；或同时加入100500mol/的AS；（4）侵染：于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一般15 分钟，不同材料处理时间不同）。取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。（5）共培养：将侵染过的外植体接种在愈伤组织诱导或分化培养基上（烟草为MS 十IAA0.5mg/L BA2.0mg/L) ，在28暗培养条件下共培养24 天（光对某些植物的转化有抑制作用，故需暗培养，共培养时间因不

4、同植物而异）。（6）选择培养：将经过共培养的外植体转移到加有选择压（以NPT为标记基因时一般使用卡那霉素，烟草以100mg/L 的选择浓度为宜，其它植物需通过敏感实验确定）的脱菌（附加250500mg/L 的羧苄青霉素或头孢霉素，抑制农杆菌生长）分化或愈伤组织诱导培养基上，在光照为200010000lx、25条件下进行选择培养。（7）继代选择培养：选择培养23 周后，外植体的转化细胞将分化出抗性不定芽或产生抗性愈伤组织，将这些抗性材料转入相应的选择培养基中进行继代扩繁培养，或转入附加选择压的生长或分化培养基中令其生长或诱导分化。（8）生根培养：待不定芽长到1cm 以上时，切下并插入含有选择压的

5、生根培养基上进行生根培养，两周左右长出不定根。（二）细菌的植物组织培养基悬浮液浸染法此方法与上述的细菌培养液直接侵染法不同之处是用于侵染的农杆菌被悬浮在植物组织培养液（如1 / 2MS 、MS 或其它培养液中），而不是细菌培养液（如YEB 或LB 等）中。具体做法有两种：（1）在超净工作台上，将按上述方法培养的OD600 为0.60.8 的菌液，转入无菌离心管中，于室温条件下，4000r/min 离心5 分钟，去掉上清液菌体用MS 液体培养基（pH5.45.8）重悬，稀释至OD600为0.2 左右，用于转化。（2）另一方法是取适量的OD600为0.60.8 的菌液加入到3050 倍体积无激素的

6、组织培养液体培养基中（pH5.8)，（同时可加入100mol/L 的AS ) ，在上述条件下继续振荡培养2 4 小时，至OD600为0.2 左右时用于侵染。说明：（1）上述的各种做法包括加入AS 及不加AS ，都能获得一定的转化率。侵染时采用哪种做法，除要根据受位材料及菌株情况选定外，也有个人的习惯。（2）如果共培养后，外植体周围菌体很多，转入选择培养时，可先用液体MS 培养基冲洗材料吸干液体后再转入选择培养基。但这种作法常常引起材料损伤，应尽量避免。（3）为提高转化细胞成活率，可采用哺育细胞看护培养及延迟筛选的方法。哺育细胞看护培羌是以迅速生长的植物细胞悬浮系（常用胡萝卜悬浮细胞系）为哺育细

7、胞。共培养对在共培养的培养基表面铺上一层哺育细胞层，然后覆盖一张无菌滤纸，将侵染后的材料成在滤纸上面进行共培养，哺育细胞的滋养有利于转化细胞成活。所谓延迟筛选是指共培养后的材料不马上转入筛选培养基中，而是先转入只含有抑制农杆菌生长的抗生素（如羧苄青霉素或头孢霉素），不含选择压（如卡那霉素）的分化或愈伤组织诱导培养基中培养5 10 天（称脱菌培养），然后再转入具有选择压的筛选培养基中进行抗性筛选。延迟筛选的好处是转化细胞受非转化细胞滋养有利于成活，缺点是常造成“逃逸”（假转化）现象及嵌合体出现。 （三）CpTI 基因叶盘法转化甘蓝材料：（1）农杆菌LBA4404 ( pRCL27 ）。（2）甘蓝

8、种子。操作：1 受体材料准备：甘蓝种子用水漂洗，70 乙醇消毒1 分钟，0.1 的升汞消毒2030 分钟，无菌水冲洗5 遍。播种于无菌0.7固体琼脂培养基上，阳光下培养67 天。2 配制培养基预培养培养基：MS IAA0.2 BA2.0共培养培养基：同上脱菌培养基：MS IAA0.2 BA2.0Cef 500mg / L筛选培养基：MS IAA0.2 BA2.0 Cef 500mg / L 十Km 25mg / L生根培养基：1 / 2 MS IBA 0.5 十Km 25mg / L抗生素用无菌滤膜过滤，添加在高压灭菌后冷至50 左右的培养基中，用力摇匀（可将磁棒与培养基一起灭菌，加入抗生素后

9、，置磁力搅拌器上搅匀）后分装于无菌培养皿中，生根培养基分装于三角瓶中。3农杆菌培养（1）挑取单菌落，接种于20mL YEB Km 25mg / L Rif 50mg / L 液体培养基中，27、180r/min培养过夜。（2）取400l 菌液转接入20mL 无抗生素的YEB 液体培养中，继续培养46 小时。（3）在超净工作台上，将菌液倒入无菌带盖离心管内，盖上管盖，用石蜡膜封口，4000r/min离心5 分钟。（4）取出离心管，在超净工作台上弃去上清。向离心管内加入适量无菌MS 液体培养基，悬浮起菌体，转入无菌容器中，用MS 液体培养基稀释至OD6000.2 。4 叶盘法转化（1）取培养67

10、天的甘蓝无菌幼苗，将胚轴剪成58mm 长的小段，子叶带子叶柄剪下，转入预培养培养基中，于25，光照条件下预培养2 天。（2）将预培养的材料取出，放在无菌的小培养皿中，保留培养基。（3）向皿中倒入稀释好的菌液，轻轻摇晃23 下，立即取出胚轴切段及子叶，置无菌滤纸上吸去多余菌液。（4）将子叶及胚轴切段放回到原预培养的培养基中，盖上培养皿盖，用石蜡膜封口，于27，黑暗中共培养2 天。（5）将材料转入到脱菌培养基中，于26 ，光照条件下培养67 天。（6）将脱菌培养基中的材料转入筛选培养基中，同样条件下培养。23 周有绿芽分化。（7）将绿芽转入筛选培养基，2 周更换一次新鲜的筛选培养基，筛选培养34

11、代，淘汰白化的及畸型苗（8）选择形态正常，生长旺盛的抗性绿苗，转入生根培养基中，15 天后可见幼根生成。待根系形成后取出小苗，自来水洗净根上的琼脂，移入珍珠岩与草炭土1 ：1 混合的基质中，于温室中培养。（9）取生长良好的植株叶片提取DNA ，进行PCR 扩增及Southern 杂交鉴定。说明：LBA4404 (pRCL27）为双元载体，所含pRCL27 质粒的TDNA 中有NPT 一l 基因和以CaMV35S 启动子调控的CpTI 基因。由中科院遗传所朱祯实验室构建。（四）悬浮细胞与农杆菌共培养转化目的：以悬浮培养的单细胞或细胞团为受体，与农杆菌共培养实现目的基因转化，并通过再生获得转基因植

12、株。材料：（1）烟草愈伤组织。（2）含NPT-基因质粒载体的农杆菌菌株。（3）悬浮培养液：愈伤组织培养基成分中增加2,4D 浓度，可至2mg/L；VB1、VB6 浓度可增至10mg/L；烟酸浓度可增至5mg/L，并加入水解酪蛋白1g/L。操作：1. 悬浮细胞系的建立(1) 在150mL 的三角瓶中加入约50mL 的悬浮培养液。(2) 取生长快，松散的愈伤组织转入悬浮培养液中，24、100r/min 振荡培养。(3) 每隔3 天转入新培养液中继代一次。2. 农杆菌培养（1）将农杆菌接种在YEB 液体培养基中，于28、200 r/min 振荡培养至OD600为0.60.8。（2）取20mL 菌液置

13、无菌离心管中，4000r/min 离心5 分钟，收集菌体。（3）用细胞悬浮培养液重悬菌体，并稀释至OD6000.25 左右，置冰上待用。（4）另一种做法是取lmL 菌液加入到50100mL 新鲜的YEB ( pH7.0）或细胞悬浮培养液中（pH5.8) ，同时加入l000mol/LAS 继续培养至OD6000.25 左右，约46 小时，放置冰上待用。3 共培养转化（1）将农杆菌液置20平衡几分钟。（2）取4mL 处于对数生长期的植物细胞悬浮液放入直径为10cm 的培养皿中。（3）再加入4mL 平衡好的农杆菌液混匀，于28静止培养2 天。4 转化体筛选（1）将共培养物低速离心（700r/min

14、) ，弃上清。（2）加入细胞悬浮培养液洗涤细胞沉淀3 次。（3）最后用含500ug/mL 羧苄青霉素或头孢霉素及100 ug/mL 卡那霉素的选择细胞悬浮培养液重悬细胞沉淀，于24100r/min 条件下进行选择培养。（4）当出现微小愈伤组织后转入固体选择培养基上进行愈伤组织继代选择培养。 5 愈伤组织分化及生根培养：愈伤组织转入附加卡那霉素的固体分化培养基中诱导分化，将分化出的幼苗转入附加卡那霉素的生根培养基中培养。说明：共培养时不要振荡，培养条件必须有利于细胞旺盛分裂，才能得到较好效果。（五）原生质体与农杆菌共培养转化目的：以原生质体为受体细胞，进行农杆菌介导的目的基因转化。材料：烟草，带

15、目的基因的根癌农杆菌。试剂 ：（1）原生质体分离缓冲液：0.07 % MES 2 , ( N吗琳)乙基磺酸 ，0.07 % CaC12 , 0.11%NaH2PO4 , 0.5mol/L 甘露醇（pH5.8）。（2）原生质体分离酶液：l%2蝜llase onozuka R10（纤维素酶R10) , 0.1% MacerozymeR10（果胶酶R10)，溶于原生质体分离缓冲液（pH5.8）。（3）16 蔗糖溶液。操作：1烟草叶肉原生质体制备：(1) 以12 周龄烟草植株为试材，选取已伸展开的幼嫩叶片按下面程序进行表面消毒：浸于70乙醇30 秒，无菌水冲洗1 次。浸入5次氯酸钠溶液（其中可加入少许

16、Tween20) 30 分钟，无菌水冲洗3 遍。浸入1次氯酸钠溶液10 分钟，无菌水冲洗3 次。(2) 无菌操作剪碎叶片，放入培养皿中，加入25mL 左右的原生质体分离酶液，于28、2030min 轻摇46 小时。(3) 用倒置显微镜观察原生质体分离情况。(4) 将分离良好的原生质体悬液，用608m 孔径的滤网过滤，原生质体进入滤液。(5) 滤液经600r/min 离心5 分钟，原生质体沉于管底，除去上清酶液。(6) 离心管内加入2mL 原生质体分离缓冲液重悬沉淀，然后在管底缓缓加人16蔗糖溶液800r/min 离心10 分钟，原生质体漂浮在蔗糖溶液与分离缓冲液中间界面上。（7）吸取原生质体，

17、用分离缓冲液洗涤，600r/min 离心3 分钟，去上清液。（8）反复洗涤23 次后供转化使用。原生质体预培养：(1) 用含0.4mol/L 蔗糖的K3 NAA0.1 KT0.2 的液体培养基重悬原生质体，使终浓度为12×105/mL。(2) 将原生质体液体培养基悬液分装于9cm 的培养皿中，每皿5mL 左右，在弱光照（400 lx）下培养至原生质体第一次分裂前。3. 农杆菌培养：(1) 将农杆菌接种于YEB 液体培养基中，在27、200r/min 条件下振荡培养至OD600为0.5 左右。(2) 将菌液转入无菌离心管中，5000 r/min 离心5 分钟收集菌体。(3) 用原生质体

18、液体培养基悬浮、稀释至细胞浓度为1×109 放置冰上待用。农杆菌培养的另一种做法是经步骤(1)后，取lmL 菌液加入到50100mL 新鲜的YEB ( pH7.0)或原生质体培养液（pH5.8）中，同时添加入AS100mol/ L，继续培养至OD600 为0.2 左右时即可直接使用。4 共培养：取5l 农杆菌加入到盛有原生质体的培养皿中轻轻地混匀，使农杆菌：原生质体约为100 : 1 ，农杆菌终浓度约为107个细胞mL 。于室温下共培养2 天。5 脱菌培养：将共培养液转入无菌离心管中，700r/min 离心5 分钟，弃上清。用原生质体培养基轻轻悬浮，再次离心，用含有500ug/mL 的羧苄青霉素的原生质体再生液体培养基悬浮，使细胞浓度约为36×104，于室温脱菌培养并诱导分裂。原生质体细胞分裂至10 个细胞期时，逐渐降低培养基中的渗透压至原始培养基的一半。6 选择培养：离心收集小细胞团及微小的愈伤组织，转至含有100200ug/mL 卡那霉素和500ug/mL 的羧苄青霉素的诱导愈伤组织或芽再生选择培养基上，进一步培养。说明：