淀粉酶发酵条件的优化

1、 本科学生综合性实验报告学号 084120402 姓名 茶金梅 学院 生命科学 专业、班级 08生技 实验课程名称 酶工程实验 教师及职称 李俊俊 开课学期 2010 至 2011 学年 上 学期 填报时间 2011 年 12 月 29 日云南师范大学教务处编印一实验设计方案实验序号三实验名称淀粉酶产生菌的发酵条件优化实验时间2010年12月实验室生物基础21 实验目的了解酶制剂生产过程中实验室发酵条件优化的基本方法。2 实验原理、实验流程或装置示意图2.1 实验原理 用微生物生产酶制剂受以下制约：培养基成分、物理条件。 为了得到最佳产酶量，必须对这些因素进行优化，并通过单因子分析、正交试验找

2、出最适合的发酵工艺条件。 碳、氮源是组成微生物细胞蛋白质、酶和核酸的主要元素之一，是影响酶产量的两个重要因素。 -淀粉酶产生菌的发酵是好氧过程，因而发酵液中的溶氧浓度是发酵过程中的一个需要调节的重要参数。 接种量大小是决定菌体在发酵培养基中生长速度的一个重要因素，选择适当的接种量是必要的。 pH是决定菌体在发酵培养基中生长速度的一个重要因素，因此最适pH的选择就显得格外重要。 发酵时间的长短决定了反应是否能完全发生，因此发酵时间也是发酵过程中的一个需要调节的重要参数。 正交试验：用正交表来安排实验分析和实验结果。 正交试验设计一般来说包括两部分:试验设计，也即方案的选择与确定； 数据处理，进行

3、统计推断。 正交试验设计的基本步骤：第一步，确定目标、选定因素（包括交互作用）、确定水平；第二步，选用合适的正交表；第三步， 按选定的正交表设计表头，确定试验方案；第四步，组织实施试验；第五步，试验结果分析。 正交试验的结果分析：极差分析、方差分析。方差分析：将总的离差平方和分解成各因素及各交互作用的离差平方和，构造F统计量，对各因素是否对试验指标具有显著影响，作F检验。 确定最优方案 如果不考虑交互作用，则根据各因素在各水平下的总产量或平均产量的高低确定最优方案；如果考虑交互作用，则取各种搭配下产量的平均数，按优化标准确定最优方案。2.2 实验流程配制种子培养基 接种 摇瓶发酵 测酶活 配制

4、发酵培养基确定最佳方案 分析实验结果3实验设备及材料3.1设备250mL三角瓶、 移液管、大试管、培养皿、电子天平、超净工作台、培养箱、恒温调速摇瓶柜、离心机（离心管）、恒温水浴锅、分光光度计、比色皿、记时器、电冰箱、3.2 试剂蛋白胨、酵母膏、NaCl、葡萄糖、NH4NO3、KH2PO4、 MgCl2·6H2O、 CaCl2·2H2O4实验方法步骤及注意事项4.1 试验方法步骤4.1.1 种子培养基的配制蛋白胨 1.0%酵母膏 1.0g% pH5.5NaCl 0.5%将菌种接种到装有种子培养基的250mL三角瓶内，于37，200rpm，培养16h。4.1.2 单因子分析4

5、.1.2.1 碳源浓度对发酵产酶的影响在六只250ml三角瓶中，依次加入0.35g（0.5%）、0.70 g（1.0%）、1.05 g（1.5%）、1.40 g（2.0%）、1.75 g（2.5%）、2.10 g（3.0%）葡萄糖，然后在六只三角瓶中都加入0.7 g NH4NO3、0.07g KH2PO4、0.035 g MgCl2·6H2O、 0.007 g CaCl2·2H2O和70ml蒸馏水，搅拌溶解，调pH至6.0，高压灭菌，冷却后各接入11.2ml（16%）的种子培养基，相同培养条件下（37，72h，200rpm）摇瓶发酵，测定酶活。4.1.2.2 氮源浓度对发酵

6、产酶的影响在六只250ml三角瓶中，依次加入0.35g（0.5%）、0.70 g（1.0%）、1.05 g（1.5%）、1.40 g（2.0%）、1.75 g（2.5%）、2.10 g（3.0%）NH4NO3，然后在六只三角瓶中均加入1.4g葡萄糖、0.07g KH2PO4、0.035 g MgCl2·6H2O、 0.007 g CaCl2·2H2O和70ml蒸馏水，搅拌溶解，调pH至6.0，高压灭菌，冷却后各接入11.2ml（16%）的种子培养基，相同培养条件下（37，72h，200rpm）摇瓶发酵，测定酶活。4.1.2.3 培养基pH对产酶的影响在七只三角瓶中各加入1.

7、4g葡萄糖、0.7g NH4NO3、0.07g KH2PO4、0.035 g MgCl2·6H2O、 0.007 g CaCl2·2H2O和70ml蒸馏水，搅拌溶解，pH依次调至3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5，高压灭菌，冷却后各接入11.2ml（16%）的种子培养基，相同培养条件下（37，72h，200rpm）摇瓶发酵，测定酶活。4.1.2.4 发酵时间对产酶的影响在六只三角瓶中各加入1.4g葡萄糖、0.7g NH4NO3、0.07g KH2PO4、0.035 g MgCl2·6H2O、 0.007 g CaCl2·2H2O和70

8、ml蒸馏水，搅拌溶解，调pH至6.0，高压灭菌，冷却后各接入11.2ml（16%）的种子培养基，摇瓶发酵（37， 200rpm）48h、60h、72h、84h、96h、108h，测定酶活。4.1.3 酶活的测定 稀释酶液4.1.3.2 操作步骤空白管样品管A样品管B步骤1吸取1.8mL淀粉底物溶液吸取1.8mL淀粉底物溶液吸取1.8mL淀粉底物溶液步骤250保温5分钟50保温5分钟50保温5分钟步骤3加入待测酶液0.2毫升加入待测酶液0.2毫升步骤450精确保温10min50精确保温10min50精确保温10min步骤5加入3mLDNS试剂终止反应加入3mLDNS试剂终止反应加入3mLDNS试

9、剂终止反应步骤6混合均匀混合均匀混合均匀步骤7加入0.2毫升待测酶液，沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸5min步骤8流水冷却流水冷却流水冷却步骤9加蒸馏水10mL，混匀加蒸馏水10mL，混匀加蒸馏水10mL，混匀步骤10OD540nm比色OD540nm比色OD540nm比色4.1.4 正交试验因素4.1.4.1 根据碳源浓度、氮源浓度、pH、接种量对酶活性的影响，每个因素选取三个水平（水平即在因素的允许变化范围内，要进行试验的“ 点 ”）进行正交试验。水平 A碳源浓度B氮源浓度C接种量D pH1最优0.5%最优0.5%最优2%最优0.52最优最优最优最优3最优+0.5%最优+0.

10、5%最优+2%最优+0.54.1.4.2 按照正交表L9 表（L是正交表的代号，L右下角的数字表示试验次数）进行试验。 试验号ABCD1111121222313334212352231623127313283213933214.1.4.3 进行方差分析4.1.4.4 得出最佳方案4.2 注意事项 灭菌锅使用时，先检查是否有水，再接通电源。 试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落。 移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或DNS时，枪头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头，实验结束后要及时清洗枪头。 精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，

11、每管之间间隔的时间要合理。 煮沸和用流水冲洗时要避免试管进水。 接种时要保证在无菌环境下操作。 分光光度计使用时应提前半小时接通电源，打开机器开关使仪器通电，自检。 测酶活时，将对照液及测定液分别装入比色杯3/4体积并用镜头纸擦干外壁，放入样品室。 读数完毕，打开仪器盖板，关闭开关，将比色杯冲洗干净、浸泡于30酒精中。 水浴锅中的水量要超过试管中的液面。 接种后应振荡接种瓶，使菌种充分与培养基混合。 正交试验设计时，确定因素应根据试验目的，选取主要因素，略去次要因素；确定因素的水平时，应尽可能的保持各因素的水平数相同，以方便试验数据的处理。5实验数据处理方法5.1 酶活的计算酶活=(0.951

12、1x+0.0493)×1000×nt×V×M（其中，0.9511x+0.0493：葡萄糖的标准曲线方程；x：OD值；n：稀释倍数；t：反应时间；V：酶液的体积；M：葡萄糖的分子量）5.2 正交试验结果的分析 利用SPSS对正交试验结果进行方差分析，得出实验的最佳方案。6参考文献1 余龙江发酵工程原理与技术应用北京：化学工业出版社，2006 2 陈守文酶工程北京：科学出版社，20083 安戈等.1株酸性-淀粉酶产生军的鉴定及发酵条件优化.安徽农业科学，20094 刘建军,姜鲁燕. 根霉PE-8菌株的选育及其淀粉降解酶类的研究 1998(02) 5 孙君社.

13、酶与酶工程及其应用.北京：化学工业出版社.20066 李春喜等.生物统计学（第四版）.北京：科学版社.2008二实验报告1实验现象与结果1.1 实验现象 发酵培养基经灭菌后颜色会发生变化，由原来的白色变为亮黄色。 摇瓶培养后，三角瓶中溶液的上方会出现一圈沉淀物。 沸水煮沸5min后，溶液的颜色加深，并且空白管中溶液的颜色比其余两管的要浅一些。 做正交试验时，摇瓶培养后三角瓶中出现了一些球状物。1.2 实验结果1.2.1 碳源（葡萄糖）浓度对发酵产酶的影响碳源浓度（%）0.51.01.52.02.53.0A管的OD值1.1521.5151.7251.9873.7642.931B管的OD值1.23

14、41.4961.6562.0013.9882.656平均值1.1931.50551.69051.9943.8762.7935酶活32.88841.14446.03254.050103.77173.8031.2.2 氮源（NH4NO3）浓度对发酵产酶的影响N源浓度(%)0.511.52.02.53.0A管的OD值0.042-0.057-0.0940.0320.0550.004B管的OD值0.043-0.023-0.0200.0510.0570.005平均值0.043-0.040-0.0570.0420.0560.0045酶活5.010004.9585.6982.9771.2.3 培养基pH对产酶

15、的影响pH3.54.04.55.05.56.06.5A管的OD值0.019-0.0110.0231.2471.7521.3791.083B管的OD值0.013-0.0110.0211.4411.6801.3911.291平均值0.016-0.0110.0221.3441.7161.3851.187酶活1.79201.95136.87746.70537.96032.7291.2.4 发酵时间对产酶的影响发酵时间（h）4860728496108A管的OD值0.1131.5001.5230.1490.1910.135B管的OD值0.1151.6211.6300.1580.1940.178平均值0.1

16、141.4461.5770.1540.1950.157酶活4.38139.57243.0335.4386.5215.5171.2.5 正交试验1.2.5.1 各个因素选取的三个水平水平A碳源浓度（%）B氮源浓度（%）C接种量（ml） D pH12.02.0145.022.52.5165.533.03.0186.0 正交试验的结果1号试验结果编号 试管AB平均值总体均值12.1972.1022.1502.10422.1642.1482.15631.9892.0232.0062号试验结果编号 试管AB平均值总平均值12.1652.2642.2152.14422.1122.1512.13232.04

17、12.1312.0863号试验结果编号 试管AB平均值总平均值10.1830.1810.1820.17920.1720.1760.17430.1770.1820.1804号试验结果编号 试管AB平均值总平均值12.0181.09321.03331.0935号试验结果编号 试管AB平均值总平均值10.3021.16820.84930.1686号试验结果编号 试管AB平均值总平均值11.3151.2951.3051.28721.2741.301.28731.2921.2811.2877号试验结果编号 试管AB平均值总平均值11.0761.0751.0761.07321.0671.0691.0683

18、1.0721.0811.0778号试验结果编号 试管AB平均值总平均值11.8791.80821.74631.7999号试验结果编号 试管AB平均值总平均值11.9652.0161.9911.98121.8972.1142.00631.9971.8961.947正交表试验号 OD平均值酶活（U/min.ml）酶活平均值（U/min.ml）12.15058.17156.9562.15658.3302.00654.36722.21559.88958.0222.13257.6962.08656.48030.1826.1786.0900.1745.9660.1806.12542.01854.68437

19、.8641.03328.6611.09330.24650.3029.34812.9850.84923.8000.1685.80861.30535.84735.5301.28735.3711.28735.37171.07629.79929.7361.06829.5851.07729.82381.87951.01249.1291.74647.4781.79948.89891.99153.97153.7152.00654.3671.94752.8081.2.3.2 正交方差分析结果SPSS分析结果整理如下：方差来源平方和自由度方差F显著性A1156.8162578.40816.494极显著B496.

20、1662248.0837.074极显著C6278.34623139.17389.516极显著D615.7362307.8688.779极显著误差631.2271835.068总和9178.291272对实验现象、实验结果的分析及其结论2.1 对实验现象的分析 由于发酵培养基的成分在灭菌的过程中会发生变化，因此培养基的颜色灭菌前后会有一定的变化。摇瓶培养后，三角瓶中溶液的上方有一圈沉淀物，说明已经发生了酶促反应，培养基中已有淀粉酶的存在了。沸水浴会使酶失活，而样品管中的酶液与底物在这之前已发生了反应，而空白管中的底物还来不及反应就已失活，故空白管中溶液的颜色要比样品管中溶液的颜色浅。摇瓶培养后三

21、角瓶中出现了一些球状物，说明培养基已被污染。2.2 对实验结果的分析2.2.1 碳源浓度对发酵产酶的影响当碳源浓度为2.5%时，淀粉酶的活性最高。2.2.2 氮源浓度对发酵产酶的影响当氮源浓度为2.5%时，淀粉酶的活性最高。2.2.3 培养基pH对产酶的影响当pH为5.5时，淀粉酶的活性最高。2.2.4 发酵时间对产酶的影响当发酵时间为为72h时，淀粉酶的活性最高。2.2.5 正交试验结果分析当碳源浓度为2.0%、氮源浓度为2.5%、接种量为16ml、pH为5.5时，淀粉酶的活性最高。2.2.6 方差分析碳源浓度、氮源浓度、接种量、pH对酶活的影响都达到了极显著的水平。2.3 结论：淀粉酶发酵条件的最优组合：碳源浓度为2.0%、氮源浓度为2.5%、接种量为16ml、pH为5.5。2 实验总结3.1 本次试验的成功之处及其原因分析 本次实