CCKB-R mRNA在幼龄厌食大鼠结肠平滑肌细胞中的表达

1、CCKB-R mRNA在幼龄厌食大鼠结肠平滑肌细胞中的表达 作者：赵琼 廖敏 丁维俊 李秀亮 瞿佳【摘要】 目的探讨胆囊收缩素受体CCKB-R mRNA在幼龄厌食大鼠结肠平滑肌细胞中的表达及加减益胃汤对其表达的影响。方法借助特制饲料喂养幼龄厌食大鼠模型，采用RT-PCR技术检测CCKB-R在幼龄厌食大鼠结肠平滑肌细胞中的表达，并观察加减益胃汤对该模型CCKB-R表达的影响。结果正常大鼠结肠平滑肌细胞中CCKB-R有低水平表达，特制饲料喂养造模后其表达水平异常增高，与空白对照组比较有极显著的统计学意义（P0.001）；加减益胃汤高、中、低剂量组均能显著抑制或下调CCKB-R的高表达，且有一定的量

2、-效趋势。结论CCKB-R基因高表达可能是厌食发生的主要病理环节之一，抑制或下调CCKB-R基因表达可能是加减益胃汤厌食症的主要作用靶点之一。 【关键词】 胆囊收缩素受体；厌食Abstract：ObjectiveTo investigate the expression of CCKB-R mRNA in colon smooth muscle cells of the anorexia pedo-rats, and the effect of modified Yi Wei Decoction on it.MethodsThe anorexia rat model was establisb

3、ed by feeding rats with specially prepared forage. The expression of CCKB-R mRNA in colon smooth muscle cells of the anorexia pedo-rats was examined by RT-PCR, and the effect of modified Yiwei decoction on it was observed.ResultsCompared with blank control, the expression of CCKB-R mRNA in anorexia

4、rats was significantly increased (P0.001). Highdosage, middledosage or lowdosage of Yiwei decoction all could obviously decrease the expression of CCKB-R mRNA as compared with model group(P0.001).ConclusionThe expression of CCKB-R mRNA can be obviously increased in colon smooth muscle cells of the a

5、norexia pedo-rats, which is one of the mechanisms of anorexia.Modified Yiwei decoction can decrease the expression of CCKB-R mRNA in colon smooth muscle cells of the anorexia rats.Key words：CCKB-R; Anorexia 近年来研究证实胆囊收缩素（CCK）等脑肠肽在小儿厌食症的发病中起着重要的作用，但对其受体表达及进一步的分子信号转导机制还不十分清楚。本研究在近年来中药复方加减益胃汤治疗小儿厌食症取得良好

6、临床疗效和我们前期研究1的基础上，借助特制饲料喂养幼龄厌食大鼠模型，对CCKB-R在幼龄厌食大鼠结肠平滑肌细胞中的表达及加减益胃汤对其表达的影响进行了初步研究。现报道如下。1 材料与仪器2 方法2.1 分组及造模2.2 样本提取与保存大鼠处死后，迅速剪取结肠中段, 生理盐水洗尽血迹，去除黏膜层, 取肌层组织并置于液氮中保存待测。2.3 RTPCR检测CCKB-R表达从美国国立卫生院所维护的国际权威数据库网站获得最新版本的CCKB-R和内参基因-actin的mRNA序列。利用引物设计专业软件Primer Primier 5.0设计其引物。然后委托大连宝生物完成引物合成。将引物溶于去离子水之中，终

7、浓度调整为20 pmol/l，20保存备用。CCKB受体引物：5-CTAAGAACGGTCACCAACG；3-GTGTAAGTAGAAGCCGTG。采用美国TriZol试剂(Cat NO: 15596-018)，按试剂盒提供的方法提取结肠中段组织中的总RNA，各组使用相同剂量的结肠中段组织总RNA。1.5%琼脂糖电泳确定质量与含量后，80保存备用。1 按试剂盒说明程序进行，先经逆转录酶系统合成cDNA。PCR仪进行CCKB-R扩增，取10 l cDNA反应液进行PCR。PCR的条件：变性：94预变性5 min，94变性1 min；退火：54，30 s；延伸72，30 s。30个循环后，72再延

8、伸10 min终止反应，4。CCKB-R PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳（电压100 V，时间30 min），取出后于紫外线下观察，利用凝胶成像系统分别测定扩增条带的积分光密度值。比较各组CCKB-R相对光密度值并进行组间统计，判定CCKB-R mRNA在幼龄厌食大鼠结肠平滑肌细胞中的表达及加减益胃汤对其表达的影响。2.4 统计学处理数据用SAS 软件包处理，计量资料均以s表示。多组资料比较用方差分析，两组资料比较用t检验。3 结果 见表1。表1 实验各组对幼龄厌食大鼠结肠平滑肌组织CCKB-R mRNA表达的影响（略）表1所示，模型组CCKB-R mRNA表达与空白组比较有显著差异（P0.

9、001）；与模型组比较，阳性药组、加减益胃汤高剂量组、中剂量组、低剂量组均使结肠平滑肌组织CCKB-R mRNA表达下调（P0.001）；与阳性药组比较，加减益胃汤各组下调CCKB-R mRNA表达程度高于阳性药组，但差异不显著；加减益胃汤各组间比较无显著性差异（P0.05），但下调CCKB-R mRNA表达水平表现为高剂量组中剂量组低剂量组，有一定量-效关系趋势。4 讨论 胆囊收缩素（cholecystokinion, CCK）是一种广泛分布于中枢及外周神经系统的典型的脑肠肽，具有调节胃肠运动、消化液分泌、摄食、情绪、记忆等多种生理功能。研究结果已证实，小儿厌食症的临床表现与八肽胆囊收缩素（

10、CCK-8）等脑肠肽水平和胃肠运动功能状态有着密切的关系。报道“病因模拟”厌食模型鼠中枢和外周CCK-8均显著增高3，但CCK受体在厌食症发病中的具体作用机制尚不十分清楚。 CCK对胃窦、幽门、小肠、胆囊平滑肌细胞有收缩作用，能增强胆囊收缩和小肠结肠的动力，且通过其受体及信号转导通路发挥其生理作用。通常认为CCK与胃肠平滑肌细胞膜上的CCK-B受体结合后使G蛋白活化，激活膜上的磷脂酶C（PLC）信号级联，通过Ca2+-CaM途径产生胃肠平滑肌细胞收缩。据此，本实验研究中幼龄厌食大鼠模型结肠CCK-B受体基因较空白组表达显著增高(P0.05), 提示幼龄厌食大鼠模型结肠CCK耦联Ca2+-CaM

11、信号通过高度活化，受体上调，使胃肠平滑肌收缩增强。然而近年的研究表明，CCK 对进食后的胃排空有抑制作用。Wechsung 等4研究发现,CCK通过舒张近端胃和提高幽门括约肌张力以及改变胃排空模式对胃排空发挥抑制作用。也有学者发现，即使是胆囊平滑肌收缩“正常”的胆囊结石患者,其CCK 受体mRNA 表达亦显著低于正常人5。因此本实验特制饲料喂养幼龄大鼠后CCK受体表达上调，可能使胃肠平滑肌收缩异常，平滑肌处于紧张或痉挛状态，胃排空抑制，胃肠运动减弱，排空减慢，进而产生饱胀感、厌食等。而加减益胃汤通过下调胃肠CCK-B受体基因表达，使高表达的CCK-B受体恢复正常，胃肠平滑肌紧张或痉挛状态缓解，

12、胃肠运动恢复正常，从而达到厌食的目的。 我们推测，由于CCK-8对摄食的控制有两种作用方式，一是脑组织分泌的CCK-8的中枢作用，二是腹迷走神经传入纤维介导的外周CCK-8的作用。而CCK 对消化管运动的调节有神经介导和直接作用于平滑肌两种途径。CCK 直接作用于平滑肌, 因需较高浓度的CCK, 故认为只有较低的亲和力。CCK 对消化管的调节被认为主要是以高亲和力的神经调节为主。因此，CCK对胃肠道平滑肌的作用主要依靠的是神经调节。但由于生理状态下体内CCK 的作用浓度还不清楚，其他激素、神经递质等与CCK在厌食发生中的相互作用影响又是怎样的，CCK受体在厌食症发病中的具体作用机制还需要我们进一步深入研究和探讨。【文献】 1赵琼，徐世军，崔敏俐.加减益胃汤治疗小儿脾胃阴虚厌食症的实验研究J.成都中医药大学学报，2005,28（3）：15.2汪受传,张月萍.特制饲料喂养幼龄大鼠建立小儿厌食模型J.南京中医药大学学报，1999，15（3）：148.3彭玉,吴高鑫.运脾散对厌食大鼠下丘脑和血浆CCK8的调节作用J.中医儿科杂志，2007，3(2):20.4Wechsung E, Houvenag