水热处理大豆

1、大豆蛋白的水热改性研究CYH，FMX，YSH摘要：本文在确定胰酶和复合酶的最佳酶解条件后，研究了不同水热预处理的温度和时间对大豆蛋白酶解敏感性的影响。并在此基础上通过响应面法分析试验进一步优化出大豆蛋白的最佳水热条件：对胰酶酶解大豆蛋白的最佳工艺条件为底物质量分数5%，水热温度125.5，水热时间21min，胰酶加入量0.5%（g/g)，酶解120min；对复合酶酶解大豆蛋白的最佳工艺条件为底物质量分数5%，水热温度122.5，水热时间22min，复合酶加入量0.5%（g/g)，酶解120min。在上述最佳条件下，大豆蛋白的水解度分别为12.84%和4.89%，与对照相比分别提高了5.99%和

2、1.30%。结果表明，水热预处理能够有效地提高大豆蛋白的酶解敏感性。关键词：大豆蛋白、水热处理、酶解、响应面分析、SDS-PAGE、FT-IR大豆蛋白由于营养价值高、成本低廉，一直是国内外研究的热点。然而天然大豆蛋白分子高度压缩、结构紧密，对蛋白酶的酶解作用具有很强的抵抗力。因此酶法改性大都存在水解效率低、酶解不彻底的问题，这严重制约了球蛋白酶法改性的实际效果，必须对其进行预处理，使蛋白变性1。水热预处理是在密闭的压力容器中（如高压灭菌锅），以水或其它液体作为介质，在高压条件下对蛋白进行加热处理。大豆蛋白在水热预处理的过程中，同时受到高温、高压的作用，其高级结构和分子间的聚集状态发生改变，紧密

3、的结构松散开，暴露出更多的酶解位点，从而提高酶解敏感性。若水热过度，则会阻碍酶对大豆蛋白的水解作用。本实验采用水热处理方法对大豆分离蛋白（soybean protein isolate，SPI）进行预处理，研究水热处理对水解度（degree of hydrolysis，DH）的影响，并通过电泳和红外光谱分析水解度与蛋白结构变化之间的关系，为其进一步开发利用提供研究基础。1 材料与方法1.1 材料与设备SPI：山东万德福植物蛋白科技有限公司；胰酶（Pancreatin）：重庆金新祥盛生物制药；复合酶（Protamex）：丹麦诺维信公司；甲醛：广州化学试剂厂。其他所有化学试剂均为分析级。YX-28

4、00 杀菌锅：合肥华泰医疗设备有限公司；SHA-BA振荡器：常州澳华仪器有限公司；PHS-3CpH计；721 可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；LGJ-12冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司；红外光谱仪为Nicolet 6700傅里叶变换红外光谱仪。1.2 方法1.2.1 大豆分离蛋白的处理SPI分散到水中配制成悬浮液4冰箱中隔夜水热处理调节温度及pH至最适酶解条件加入蛋白酶酶解沸水浴中灭酶15min冷却至室温测量水解度/溶解性冷冻干燥凝胶电泳实验傅里叶变换红外光谱分析1.2.2水解条件的确定本实验目的是研究水热法对SPI酶解敏感性的影响。由于预处理后暴露的酶切位点难以预测，因此

5、选用酶切位点广泛的蛋白酶，如胰酶和复合酶2-4，这样可以使预处理对酶切位点的暴露作用更明显，方便研究。通过前期实验，确定底物质量分数为5%，蛋白酶与底物之比（E/S）为0.5%（g/g）。不同蛋白酶水解反应条件如表1。表1 胰酶和复合酶的水解反应条件Table 1 The hydrolysis conditions of pancreatin and protamex蛋白酶pH值温度（）酶解时间（min）胰酶7.555120复合酶7.0501201.2.3 水解度的测定采用甲醛电位滴定法5-6。按式（1）、（2）计算DH 值：（1）-（2）式中：V样为滴定样品消耗标准NaOH溶液的体积/mL；

6、V空为滴定空白消耗标准NaOH 溶液的体积/mL；CNaOH为滴定时标准NaOH溶液的浓度/(mol/L)；M为1mL 1mol/L NaOH 相当于N 的质量，M 0.014；m为样品质量/g。1.2.4 水热预处理方法将大豆蛋白悬浮液置于高压灭菌锅中进行水热处理。选取影响较大的两个因素加热时间和加热温度作为考察因素，根据单因素实验结果确定不同蛋白酶水热预处理条件。结果表明，胰酶和复合酶水热处理所对应的水热温度均为122126，水热时间均为1224min。根据中心组合设计试验（Central Composite Design，CCD）7，通过Design-Expert 软件设计响应面优化模型

7、，设水热温度(X1) 、水热时间( X2) 两因素为自变量，DH为响应值，进行响应面试验，实验设计见表2。上述每个试验均进行2次，对应的响应值取2次实验结果的平均值。表 2 响应面因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface analysis因素水平-1.414-1011.414水热温度X1/122122.59124125.41126水热时间X2/min1213.761822.24241.2.5 蛋白质溶解度的测定在上述酶解条件下，蛋白的内部结构变化比较大，为了能有效检测蛋白内部结构的变化情况，进行溶解度测定、电泳实验和红外分析实验的蛋

8、白样品水解时加酶量改为E/S=0.05%，水解时间改为60min，水热预处理条件取最适。蛋白的溶解性采用氮溶指数（Nitrogen solubility index，NSI）表示。将0.6%的样品溶液常温下搅拌1h，然后离心（12,000 g，30min，20）取上清液。上清液中的蛋白含量采用改进的 Lowry 法8测定，利用牛血清蛋白（BSA）做标准曲线，测定 500 nm 处的吸光值，根据样品中蛋白质含量和上清液中蛋白质含量比值计算溶解度。1.2.6 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验（SDS-PAGE）SDS-PAGE实验参考 Laemmli 的方法9。将干燥蛋白样品溶解于样品缓冲液

9、（0.0625MTris-HCl buffer (pH 6.8)，含有2% (w/v) SDS，5% (v/v) 巯基乙醇，25% (v/v)甘油和 0.01% (w/v)溴酚蓝）中配置成浓度为 10 mg/mL 的分散液。95下煮 5 min，离心后（12,000 rpm，10 min，20）取上清液。每个样品（浓度为0.6g/ml）的上样量为10 L。凝胶电泳在恒流下进行，在浓缩胶中电流为40mA，进入分离胶后增至80 mA。凝胶染色及脱色后，与凝胶成像系统中进行成像处理。标准蛋白样品分子量范围 6,500200,000 kD。1.2.7 傅里叶变换红外光谱分析（Fourier trans

10、form infrared, FTIR）实验采用傅立叶变换红外光谱仪 Nicolet 6700型，称取干燥蛋白样品26 mg ，加入 0.15 g 左右的 KBr，一起研磨混制均匀，压片，平衡 1 min。以干燥空气为背景，用红外光谱仪扫描，测定波段为 4000400cm-1，扫描次数为16次。FTIR 图谱实际上是样品吸收强度I样与 KBr吸收强度I0的比值，与I样成比例。1.2.8 图谱处理参照穆利霞10的方法，用 PeakFit v4.12 软件对位于16001700 cm-1波段属于酰胺带特征峰的图谱进行分析。先校正基线，然后用 Gaussian 去卷积，再用二阶导数拟合，进行多次拟合

11、使残差最小。根据峰面积计算各二级结构的相对含量。其中各子峰与二级结构对应关系为：16151637 cm-1和 16821700 cm-1为 -折叠；16461664 cm-1为 -螺旋；16371645 cm-1为无规则卷曲；1 6641681 cm-1为 -转角。2 结果与讨论2.1水热处理条件对大豆分离蛋白水解度的影响响应面法（response surface method，RSM）是利用合理的试验设计并通过对试验得到的一些数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，最终通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。响应面法不仅能考察水解条件中的各个

12、关键因素，而且能同时考察各种显著因素之间交互作用对优化结果的影响，从而得到最优的水解条件11。 本实验采用CCD中心组合设计试验，水热处理条件对胰酶酶解大豆分离蛋白水解度的影响试验安排及结果见表3。回归模型方差分析及回归方程系数显著性检验见表4。表3胰酶水热预处理试响应面验设计及结果Table 3 Design and results of response surface tests for optimizingHydrothermal pre-treatment process试验号X1温度/X2时间/minDH/%实际值预测值1-1-112.0211.5821-112.2312.113-

13、1112.2412.1241112.7312.935-1.414011.4711.8261.414012.8712.7770-1.41411.2411.59801.41412.6612.5590012.7512.67100012.8812.67110012.6612.67120012.5512.67130012.5012.67表 4 回归模型方差分析及回归方程系数显著性检验Table 4 Significance test for variance analysis and coefficientconstants of regression model方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模

14、型2.6250.525.860.0192*X10.9010.9010.040.0158*X20.9310.9310.400.0145*X1X20.02010.0200.220.6539X120.2510.252.740.1417X220.6210.626.890.0341*残差0.6370.089失拟误差0.5330.187.560.0400*纯误差0.09440.023总误差3.2512注：“*”表示P0.01水平上极显著；“*”表示 P0.05不显著。以DH为响应值进行实验，利用Design-Expert 软件对表3 的试验结果进行二次多元回归拟合，得到水解度对编码X1、X2的二元多次回归

15、模型方程：水解度12.67+0.33X1+0.34X2+0.070X1X20.19X120.30X22根据回归模型方程可作出响应面分析图和等高线图，结果可见图 1。由表 4 可知，水热预处理所选用的响应面模型显著(P0.05)，失拟误差显著(P=0.04000.05)，模型决定系数（R2）为0.8072，这表明该模型拟合程度一般，但可用回归模型方程分析水热预处理大豆蛋白的条件。由表 4 还可分析出一次项水热温度(X1)、水热时间(X2)对 DH 的影响显著(P 0.05)；二次项中水热温度(X12)对 DH 的影响不显著(P 0.05)，而水热时间(X22)对DH的影响显著(P 0.05)；交

16、互项中温度和时间(X1X2)对DH 的影响不显著(P 0.05)。从回归方程的一次项系数可以看出2因素影响大豆分离蛋白水解度的大小顺序为：反应时间反应温度。利用软件对图1进行模拟寻优分析，可得到回归模型的最大值点即水热预处理的最佳条件：温度 125.5、时间 21min，DH 预测值为 12.96%。随后对水热预处理最佳条件进行验证，实测得到 DH 值平均为12.84%，与预测值较接近。图 1 两因素交互作用对大豆蛋白DH值的影响Fig. 1 Effect of cross-interaction among factors on DH of SPI水热处理条件对复合酶酶解大豆分离蛋白水解度的

17、影响试验安排及结果见表5。回归模型方差分析及回归方程系数显著性检验见表6。表 5水热预处理试响应面验设计及结果Table 5 Design and results of response surface tests for optimizingHydrothermal pre-treatment process试验号X1温度/X2时间/minDH/%真实值预测值1-1.000-1.0004.404.3321.000-1.0004.644.593-1.0001.0004.814.8341.0001.0004.594.635-1.4140.0004.414.4461.4140.0004.475.4

18、770.000-1.4144.464.5480.0001.4144.984.9390.0000.0004.444.55100.0000.0004.594.55110.0000.0004.574.55120.0000.0004.694.55130.0000.0004.454.55表 6 回归模型方差分析及回归方程系数显著性检验Table 6 Significance test for variance analysis and coefficientconstants of regression model方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型0.2950.0586.370.0154*X11

19、.374E-00311.374E-0030.150.7089X20.1510.1516.500.0048*X1X20.05310.0535.820.0466*X120.01510.0151.660.2392X220.06110.0616.990.0361*残差0.06479.089E-003失拟误差0.02036.647E-0030.610.6438纯误差0.04440.011总误差0.3512注：“*”表示P0.01水平上极显著；“*”表示 P0.05不显著。以DH为响应值进行实验，利用Design-Expert 软件对表5 的试验结果进行二次多元回归拟合，得到水解度对编码X1、X2的二元多

20、次回归模型方程：水解度4.55+0.013X1+0.14X20.12X1X20.047X12+0.093X22根据回归模型方程可作出响应面分析图和等高线图，结果可见图 2。由表6可知，水热预处理所选用的响应面模型显著(P 0.05)，失拟误差不显著(P 0.6438 0.05)，模型决定系数（R2）为0.8198，这表明该模型拟合程度一般，但可用回归模型方程分析水热预处理大豆蛋白的条件。由表 6 还可分析出一次项温度(X1)对 DH 的影响不显著(P 0.05)，而时间(X2)对 DH 的影响极显著(P 0.01)；二次项中温度(X12)对 DH 的影响不显著(P 0.05)，但时间(X22)

21、对 DH 影响显著(P 0.05)；交互项中温度和时间(X1X2)对DH 的影响显著(P 0.05)。从回归方程的一次项系数可以看出2因素影响大豆分离蛋白水解度的大小顺序为：反应时间反应温度。利用软件对图2 进行模拟寻优分析，可得到回归模型的最大值点即水热预处理的最佳条件：温度 122.5、时间 22min，DH 预测值为 4.83%。随后对水热预处理最佳条件进行验证，实测得到 DH 值为4.89%，与预测值的误差为 0.06% 5%，与预测值较接近。图 2 两因素交互作用对大豆蛋白DH值的影响Fig. 2 Effect of cross-interaction among factors o

22、n DH of SPI2.2 水热处理对大豆蛋白溶解度的影响蛋白质溶解性的高低实质上反映的是蛋白质水化能力的强弱。蛋白质与水之间的作用力主要是蛋白质中的肽键（偶极-偶极相互作用或氢键），或氨基酸的侧链（离子化、极性基团以及非极性基团）与水分子之间发生的相互作用12。大豆蛋白经不同处理后的溶解度变化如图3所示。从图3中，我们可以看到，与仅经过Pancreatin和Protamex酶解的SPI的溶解度（37.65%、40.23%）相比，水热预处理后的溶解度都有所增加，分别为43.64%，44.64%。这说明水热预处理对SPI的溶解度有一定改善作用，与之前文献报道一致13-14。水热处理增溶的机制可

23、能是：（1）破坏分子间的非共价键从而使不溶性蛋白转化为可溶性蛋白13；（2）破坏蛋白质分子高级结构，使蛋白质分子展开，增加带电基团，提高溶解性12。图3 不同处理后的蛋白溶解度变化Fig.3The solubility change of SPI after different treatments2.3 大豆蛋白经不同处理后的SDS-电泳实验图4不同处理后大豆蛋白的 SDS-PAGE 图Fig.4 SDS-PAGE electrophoretic proles of SPI after different treatments1-大豆蛋白，2-胰酶酶解，3-复合酶酶解，4-水热处理1（T=1

24、25.5，t=21min）, 5-水热处理2（T=122.5，t=22min）, 6-水热1+胰酶酶解, 7-水热2+复合酶酶解M：蛋白标准品为了进一步了解水热预处理对大豆蛋白酶解敏感性的影响，对经不同处理的样品进行SDS-PAGE分析，观察水热预处理前后大豆分离蛋白酶解产物中各亚基的变化。由图4可见，对照大豆蛋白主要由-7S、-7S、-7S、A-11S 和B-11S组成。与对照相比，大豆蛋白经水热预处理后，-7S、-7S、-7S、A-11S 和B-11S的颜色变浅,这可能是因为水热处理对大豆蛋白的亚基有一定的降解作用，引起蛋白质亚基的解离，分子结构的展开。仅进行胰酶酶解的大豆蛋白亚基变化如下

25、：-7S、-7S和-7S 完全消失，而A-11S 和B-11S的颜色变浅。与之相比，经过水热处理后再进行胰酶酶解，大豆蛋白的亚基变化较大，分子量较小的条带颜色变深，-7S、-7S、-7S、A-11S和B-11S均完全降解。这可能是由于水热处理改变了大豆蛋白的高级结构和其分子间的聚集状态，使其紧密的结构松散开，暴露出更多的酶解位点，然后再进行酶解，不仅使酶解敏感性得到很大的提高，同时也让溶解性得到提高，与前面的实验结果一致。Utsumi 15研究了热处理中大豆球蛋白和大豆伴球蛋白的相互作用，加热导致分子解离，然后形成了分子量大于100万道尔顿的可溶性聚集体。仅进行复合酶酶解的大豆蛋白亚基变化如下

26、：-7S、-7S、-7S 和 A-11S完全消失，而 和B-11S的颜色变浅。与之相比，经过水热处理后再进行复合酶酶解，大豆蛋白的亚基变化不大，分子量较小的条带颜色变深，-7S、-7S、-7S、A-11S和B-11S均完全降解。这说明了大豆蛋白经过水热处理后，进行复合酶酶解，小分子物质增加，大豆蛋白的溶解性提高，与前面的实验结果一致。2.4 傅里叶变换红外光谱分析有研究表明，高温和高压相联合对破坏大豆蛋白中的二硫键具有协同增效作用，因此可使已发生变性聚集的蛋白分子展开16。故推测水热处理会对大豆蛋白的结构产生一定的影响，因此测定大豆蛋白在水热处理前后二级结构的变化。FTIR是研究蛋白质二级结构

27、的新兴方法，将其与去卷积（Deconvolution)、二阶导数谱(Second derivativespectrum)和曲线拟合(Curve-fitting)等数学处理方法相结合，可以定量分析蛋白质中各种二级结构的含量17。图5大豆分离蛋白在处理前的红外光谱酰胺I带的拟合曲线Fig.5 Deconvoluted infrared spetrua of amideband of SPI 表7 大豆分离蛋白处理前酰胺I带Table 7 The secondary structure of SPI峰位置（cm-1)峰面积峰的指认所占的百分含量（%）1618.42.30-折叠43.361631.53

28、.88-折叠1686.52.11-折叠1645.23.98无规卷曲20.821658.83.79-螺旋19.821672.53.06-转角16.00大豆分离蛋白在处理前的红外光谱I带的拟合曲线如图5所示。大豆分离蛋白在处理前结构是以-折叠为主，如表7所示，1618.4cm-1、1631.5cm-1和1686.5cm-1的峰被指认为-折叠，其比例占到了43.36%；1 645.2 cm-1的峰被指认为无规卷曲，所占的比例为20.82%，排在第二位；1658.8cm-1的峰为-螺旋，所占比例为19.82%；峰位置在1672.5cm-1的-转角结构含量最少，仅占16.00%。本试验的结果与之前文献报

29、道18的大豆分离蛋白的二级结构组成基本一致。图6大豆分离蛋白处理后的红外光谱酰胺I带的拟合曲线（A）水热处理1（T=125.5，t=21min）, （B）水热处理2（T=122.5，t=22min）Fig.6 Deconvoluted infrared spetrua of amideband of various treated SPI （A）Hydrothermal pre-treatment1；（B）Hydrothermal pre-treatment2表8不同处理的大豆分离蛋白酰胺I带拟合数据Table 8 The secondary structure of various trea

30、ted SPI处理方式-折叠含量（%）无规卷曲含量（%）-螺旋含量（%）-转角含量（%）对照43.3620.8219.8216.00水热141.5321.5020.5116.46水热241.7221.2620.4816.53 不同水热处理后的大豆蛋白红外拟合谱图及蛋白质酰胺I带拟合结果如图6和表8所示。在SPI的二级结构中，-折叠占主要地位，它是肽链主链伸展的一种有规则的结构，相邻平行的肽链之间的-NH 和 C=O 形成氢键，顺向平行的氢键间隔一致但交错倾斜，反向平行的氢键间隔有疏有密19。从蛋白质的化学性质可知，当蛋白质二级构象发生变化时，主要是-折叠结构发生变化10。从表8数据知，大豆蛋白

31、经过水热1处理后，-折叠含量由未处理样品的43.36%减少为41.53%，同时无规卷曲、-螺旋以及-转角结构的含量分别增加到21.50%、20.51%和16.46%。水热2与水热1处理后的结果类似，-折叠含量减少到41.72%，无规卷曲、-螺旋以及-转角结构的含量分别增加到21.26%、20.48%和16.53%。这说明大豆蛋白的结构在高温高压条件下发生改变，其中维持-折叠结构的氢键部分断裂，蛋白发生变性。-折叠是蛋白分子二级结构中的主要存在形式，其含量越少表明肽链排列越无规律，结构越为松散19；-转角以及无规卷曲结构中不存在氢键或其它的相互作用，可以使肽段中的各个残基间具有更多的自由性20，

32、其含量增加也说明蛋白质结构趋向松散。由此我们可以推断在蛋白质三级结构上也发生了相应的变化，使得深埋于分子内部的疏水基团得以暴露，有助于提高大豆蛋白的酶解敏感性，表现为大豆分离蛋白水解度和溶解性的提高，与上文实验结果一致。刘燕燕等21研究了热处理对大豆蛋白结构的影响，发现热处理会引起蛋白质展开，-折叠和-螺旋含量减少，-转角结构增加。对比刘燕燕的研究结果，我们可以知道水热处理引起的蛋白质变化程度和变化的部位与热处理的并不一样，可能是高压环境下，水分子更容易进入肽链之间，对氢键破坏程度更大，使-折叠同时向无规卷曲、-螺旋和-转角结构发生转变，而热处理则使-折叠和-螺旋向-转角结构转变。3 结论（1

33、） 在确定的酶解条件下，对大豆分离蛋白进行水热预处理能够有效地提高其酶解敏感性。通过响应面实验得到对胰酶酶解大豆蛋白的最佳工艺条件是底物质量分数5%，水热温度125.5，水热时间21min，胰酶加入量0.5%（g/g)，水解120min；对复合酶酶解大豆蛋白的最佳工艺条件是底物质量分数5%，水热温度122.5，水热时间22min，复合酶加入量0.5%（g/g)，水解120min。在上述最佳条件下，大豆蛋白的水解度分别为12.84%和4.89%，与对照相比分别提高了5.99%和1.30%。（2） 与仅经过Pancreatin和Protamex酶解的SPI的溶解度（37.65%、40.23%）相比

34、，水热预处理后的溶解度都有所增加，分别为43.64%，44.64%。这说明水热预处理对SPI的溶解度有一定改善作用。（3）通过SDS-PAGE实验，可以得知经过水热处理后再进行胰酶酶解，大豆蛋白的亚基变化较大，分子量较小的条带颜色变深，-7S、-7S、-7S、A-11S和B-11S均完全降解。经过水热处理后再进行复合酶酶解，大豆蛋白的亚基变化不大，分子量较小的条带颜色变深，-7S、-7S、-7S、A-11S和B-11S也完全降解。（4）对SPI的红外光谱图大豆蛋白经过水热处理后，-折叠含量减少，同时无规卷曲、-螺旋以及-转角结构的含量有所增加。这说明大豆蛋白的结构在高温高压条件下发生改变，其中

35、维持-折叠结构的氢键部分断裂，蛋白发生变性。参考文献1 陈林，吴克刚，柴向华，余林，刘晓丽，陈琰华。物理预处理改善食品蛋白酶解特性的研究进展J。食品与发酵工业，2013，39（10）：33-382 Barca A. M. C., Ruiz-Salazar R. A., Jara-Marini M. E. Enzymatic hydrolysis and synthesis of soy protein to improve its amino acid composition and functional propertiesJ. Journal of Food Science, 2000,

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