USP1223-微生物替代方法的验证

1、精选优质文档-倾情为你奉上微生物替代方法的验证本章的目的是为官方法定微生物学方法的替代方法的验证提供指导。由于如经济、产量、方便等各种原因，对于那些通论里的微生物回收率和鉴定，微生物检验实验室有时候会使用其他的检测方法。对于这些方法的验证是必要的。通用需知中的检测和分析部分提供了对这些替代方法的验证指导。这部分内容中提到，如果发生争议，以法定方法的结果为准。替代微生物学方法的验证研究应考虑到大量的变量，例如使用传统的平皿计数法进行微生物检测时，其结果的RSD（1530）经常会比常用的化学分析的RSD（13）大。许多传统的微生物学方法都受制于取样误差、稀释误差、涂平皿误差、培养误差和操作误差。法

2、定方法的验证定义了准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、限度、重现性和稳定性在分析方法中应用的特征。这些定义不太适用于至少等价于法定方法的替代微生物学方法验证，此替代方法给出了相似性质的问题（参阅“通用的关系”中检测和分析的步骤部分）。关键问题是替代方法得到的结果是否等价于，甚至好于传统方法得到的结果。其他行业组织也提供了替代方法的验证指南*。一个新的或改良的方法的适用性要经过该替代方法与美国药典法定方法的比较来证明。本章定义的一些特性可能被用于建立这种比较。微生物学检测的种类对检测中以替代方法命名的部分进行鉴别对验证来说很重要。比如说，很多技术都可用来鉴定活细胞的存在。这些技术可能应

3、用于各种检测（如生物负载，无菌检测），但实际上他们不能完全代替检测中的重要部分。比如说，一个用滤膜过滤的无菌检测可能用法定方法进行到把加工过的滤器和回收培养基放一起，然后活细胞的存在可能用一些可用的技术来证明。这个应用的验证就要求验证所应用的回收系统而不是整个检测。对于微生物学检测有三种特殊的测定，包括样品中是否有微生物的判定检测；微生物数量的定量检测（或样品中特殊亚群的计数）和用于鉴定微生物种类的检测。本章不介绍微生物的鉴定。微生物存在或缺乏的定性试验这种试验的特点是以液体培养基的浊度作为判定测试样品中存在活体微生物的依据。这个试验最常见的例子是无菌检测。这个试验的其他例子有那些用于判断样品

4、中某一特定微生物是否存在的检测（如：饮用水中的大肠菌群和口服制剂中的大肠埃希氏菌）。微生物的定量检测平板计数法是这类用于估算样品中活体微生物数量的检测中最常用的例子。滤膜过滤法和最大或然数（MPN）多管法是这些检测的另一些例子。后者发展成为一种估算无法用于直接涂板法和膜过滤法的样品中存在的活体微生物数量 方法。通用的关系一个微生物学方法的验证是实验方法建立的过程，与传统方法相比，方法的性能特征符合应用要求。例如，没必要对在抗菌功效测试中用的新的定量方法的整个等价内容进行比较研究来验证，因为重要的是计数用的新方法和平板计数法（目前的计数方法）之间的比较。作为定量试验，从本质上说，它们产生用数字表

5、示的数据，允许使用参数统计方法。与此相反，定性的微生物分析，如：上述例子中的无菌检测，可能要求用非参数统计方法进行分析。化学分析中分析方法的验证遵循在法定方法验证（1225）中描述的成功建立的参数。微生物学方法的验证也服从其中一些关系，虽然要考虑到微生物分析的特殊性质（见表1）。表1 各种微生物学检验类型的验证参数参数定性检测定量检测准确性NoYes精确性 NoYes专属性YesYes检测限YesYes定量限NoYes线性NoYes运用范围 NoYes稳定性 YesYes可重复性YesYes重现性YesYes样品中活体微生物定性检测的验证专属性单指促生长实验，已经进行该实验项目一个替代定性微生

6、物学方法的专属性是指它用于检测可能存在于受测样品中的一系列微生物的能力。这种关系被恰当地命名为定性方法的培养基促生长。这种定性方法依靠菌落的生长来证明微生物的存在与否。但是，对于那些不需要菌落生长来指示微生物存在的方法，微生物分析的专属性保证了检测系统中的外来物质不影响检测。检测限未进行此相关实验检测限是指在规定的实验条件下可检测出来的样品中的最低微生物数量。微生物学检测限决定了微生物存在与否，比如，10克中没有检出沙门氏菌属。由于微生物学本身的性质，检测限是指任何稀释或培养步骤之前的原始样品中所含的微生物体的数量而不是检验时检出的微生物体数量。用一种方法来证明一个定量分析的检测限就要用此方法

7、去评估替代方法和法定方法。评估办法就是培养少量的挑战微生物（不多于5CFU/皿）然后计数回收率。调整培养水平使法定方法中有至少50%样品中微生物出现生长现象。一个试验的检测限经过多次重复试验（至少5次）才能确定，因此这个试验要重复多次。这两个方法检测低浓度培养物的能力可以用2检验来表示。用于证明这两种方法等效性的第二种方法是最大或然数法。在这种方法中，替代方法和法定方法均要用到10倍系列稀释的5管菌液。然后用等价的接种体做挑战（如：50CFU/mL的原菌浊液经10 1、10 2和 10 3稀释后分别得到5、0.5和0.05CFU/管的目标接种体）。原菌液的最大或然数由各个方法来确定。如果95的

8、置信区间重叠，则这两种方法被视为等价。重现性报告中需要增加的内容定性微生物学方法的重现性是指在各种正常的检验条件下，如不同的分析员、不同的仪器、不同生产商的试剂和不同的实验室，对同一样品进行分析所得检验结果的精确程度。重现性可以定义为内在的对由操作和环境变化对微生物学方法结果造成的影响的抵抗。重现性是最适合经常用到各种仪器和各批成分的检测方法的供应商用来做决定的验证参数。稳定性验证报告需要调整的部分，例如试剂、培养基等的改变对实验的影响定性微生物学方法的稳定性是指一个方法保持不受那些少的但经过考虑的方法参数变化的影响的能力，并且显示了它在正常使用中的可靠性。稳定性是最适合检测方法的供应商用来做

9、决定的验证参数。由于目前的方法没有可认同的标准，因此接受标准是有问题的，必须按特定的技术进行调整。但是，最基本的是建立起对替代程序的稳定性的评估。稳定性的测量不是替代方法和传统方法间必要的比较，而是替代方法验证的必要组成，这样使用者就能知道方法的使用参数。样品中活微生物体定量估算的验证未按照该文执行，方案未提及由于菌落形成单位服从泊松分布，因此建议使用适合泊松的统计工具而不使用正态分布进行分析。如果使用者更习惯于使用适合正态分布的工具，则数据转换会被经常用到。这两种统计方法很方便，也很适用于微生物学数据。原始计数可以通过用它的log10对数值或者它的平方根1两种方法转换成正态分布数据。后一种方

10、法对于含有零的数据尤其有帮助。准确度未按照该文执行，方案未提及这种微生物学方法的准确度是指替代方法的检测结果与传统方法检测结果的接近程度。它通过方法的使用范围来表示。准确度通常以检测方法中微生物的百分回收率来表示。准确度在一个定量微生物检测中可能通过制备在检测范围上限的菌悬液来表示。此检测范围上限的菌悬液经过系列稀释直到检测范围下限。替代方法中的使用范围应覆盖传统方法中的范围。例如，如果活体计数的替代方法打算要取代传统的平板计数法，那么一个合理的范围可能是从100 to 106CFU/mL。每种微生物在检测范围内至少要做5个菌悬液。替代方法估算出的活微生物体数不得少于传统方法算得的70，或者说

11、通过适当的统计分析（如一个数据点的log10对数值的方差分析），新方法应该与传统方法得到同样多的微生物。应该注意到一种可能性的存在：一个替代方法可能回收到更多微生物，如果它不依赖微生物的生长来形成菌落或增加浊度。这会在专属性评价中做限定。精密度报告中需要增加所有项目的RSD数值定量微生物学方法的精密度是指当程序在检测范围内重复应用于多个试验菌悬液样品时，每个独立检测结果之间的符合程度。微生物学方法的精密度通常用标准偏差或相对标准偏差（变异系数）来表示。但是，其它合适的计量方法也可能被使用。表示精密度的一种方法使用检测范围上限的菌浊液，此检测范围上限的菌悬液经过系列稀释直到检测范围下限。检测范围

12、内应至少分析5个菌浊液。每个菌悬液至少重复10次，以便于计算统计学中标准偏差或相对标准偏差（变异系数）的显著性评估。此处未做到重复10次通常，可接受的RSD在1535之间。除去特殊的结果，替代方法的变异系数不应大于传统方法的变异系数。例如，列于下表的平板计数法的RSD范围。表2 不同平板菌落数的期望RSDcfu 皿期望 RSD30300 15%1030 25%10 35%专属性未按照该文执行，方案未提及定量微生物学方法的专属性是指它检测一组微生物的能力并显示这个方法与它要达到的目的相吻合。针对替代方法的目的使用合适的微生物展示了这种展示性。重要的是用一种与传统方法相比可以促进假阳性（对替代技术

13、特异）来证明替代方法的适用性的方式来挑战此替代技术。这个对于那些不需要菌落数量增长（如，任何不需要增殖或微生物计数在150个之间）的替代方法尤其重要。定量限未按照该文执行，方案未提及定量限是指可以准确计算的最低的微生物数量。由于不可能获得一个含有已知微生物数量的可信的样品，因此重要的是检测方法的定量限是用检测使用范围中至少5个不同点，每点大于5个重复来确定的。替代方法的定量限应低于传统方法的定量限。应该注意到，鉴于细菌计数的特性和细菌计算的泊松分布，会有个内在的定量限（参见药典收载的药品的微生物回收率验证）。因此，替代方法只需证明它对相似的低限定的灵敏度和传统方法一样。线性未按照该文执行，方案未提及微生物定量检测的线性是指它载一个指定范围内得到和样品中微生物浓度成比例的结果的能力。线性的确定应该在检测的整个范围内。用于确定线性的方法应该选择每个标准挑战微生物至少5个浓度，每个浓度进行至少5次重复。合适的测算应该用上述方法得到的数据的线性回归分析计算相关系数的平方，r 2。如果相关系数没有呈现线性，有一个方便和常用的测算来估计它们的关系。替代方法的r 2不得少于0.95。检测限见“样品中活体微生物定