固定化酶法制备单葡萄糖醛酸甘草次酸

1、固定化酶法制备单葡萄糖醛酸甘草次酸摘 要甘草酸（glycyrrhizic acid, GL）是甘草的主要有效成分，具有抗炎症，抗病毒，抗肿瘤，抗过敏等作用，而且具有较好的甜味性能。甘草酸在-葡萄糖醛酸苷酶（-Glucuronidase）作用下能特异的水解分子中远端的葡萄糖醛酸基，得到单葡萄糖醛酸甘草次酸（glycyrrhetic acid 3-O-mono-b-D-glucuronide, GAMG），作为GL的衍生物，其在抗炎和抗过敏活性上等同或超过GL，而且具有显著的抗癌作用，同时GAMG是一种新型的天然甜味剂，甜度约是GL的5倍。固定化技术是指将具有化学催化活性的生物催化剂（酶或细胞）进

2、行固定，即定位于一定的空间范围内，实现催化反应。固定化技术可以克服自由酶的不足，使酶可以回收及重复使用，从而成为生物技术中最为活跃的研究领域之一。利用固定化-葡萄糖醛酸苷酶对甘草酸进行转化，制备得到单葡萄糖醛酸甘草次酸。本实验主要研究了-葡萄糖醛酸苷酶的固定化方法及其稳定性，应用固定化-葡萄糖醛酸苷酶转化甘草酸，并对影响转化的主要因素进行了研究。关键词 -葡萄糖醛酸苷酶 固定化 甘草酸 单葡萄糖醛酸甘草次酸 Preparation of glycyrrhetic acid mono glucuronide by immobilized -glucuronidaseABSTRACTGlycyrr

3、ihizic acid(GL) is a major ingredient of licorice, and it is known for its physiological activities, such as anti-inflammation, antitumor, anti-allergy and antivirus effects. Glycyrrihizic acid was hydrolysed by -glucuronidase, losed its distal glucuronide and successfully prepared glycyrrihetic aci

4、d monoglucuronide (GAMG). Glycyrrihizic acid would lose a group of glucuronic acid by the hydrolysis of -glucuronidase, and prepared GAMG which was a high intensity sweetner and has a higher biological activity. Immobilized enzyme technology means to immobilize biocatalyst such as enzyme or cell, th

5、at is to locate the biocatalyst in centain area. Immobilized enzyme could overcome the shortcomings of free enzyme, so it could be used in repetition. So it has been applied into many fields, such as food, chemical industry, medicine, chemical analysis, and so on.In this research, immobilized -glucu

6、ronidase was used in the preparation of glycyrrhetic acid mono glucuronide. The immobilization method and its stability was studied, and the factors which had effects on the biotransformation were also studied.KEYWORDS: -glucuronidase；Immobilization；Glycyrrhizic acid；Glycyrrihetic acid monoglucuroni

7、de；目 录摘 要1ABSTRACT2第1章 文献综述51.1 甘草酸的研究进展51.2 单葡萄糖醛酸甘草次酸的研究进展5单葡萄糖醛酸甘草次酸的制备方法61.2.2 单葡萄糖醛酸甘草次酸的应用61.3 -葡萄糖醛酸苷酶简介7 高等动物组织中的-GUS81.3.2 软体动物消化液中的-GUS81.3.3 微生物中的-GUS81.4 固定化技术的研究概况91.4.1 固定化技术的用途及发展前景91.4.2 固定化的方法9第2章 材料和方法112.1 试剂和仪器112.1.1 试剂112.1.2 仪器112.2 实验方法12 HPLC含量测定方法122.2.2 -葡萄糖醛酸苷酶活力的测定132.2.

8、3 固定化方法132.2.4影响固定化酶稳定性的因素13第3章 结果与讨论143.1 -GUS固定化酶的制备143.1.1 凝胶包埋体系的选择.143.1.2 酶粉加入量的确定143.2 固定化酶的稳定性153.2.1 温度对固定化酶稳定性的影响153.2.2pH对固定化酶稳定性的影响16参考文献17第1章 文献综述1.1 甘草酸的研究进展甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)为豆科植物，其药用部位为干燥的根及根茎。甘草的主要化学成分为三萜类化合物、黄酮类化合物2。甘草酸(glycyrrhizic acid, GL)亦称甘草皂苷、甘草甜素，是甘草中含量最高的三萜化合物，

9、也是甘草的主要药效成分。甘草酸的苷元为三萜化合物甘草次酸，其糖基部分为通过两个b-1, 2糖苷键相连的葡萄糖醛酸基（图1-1）。在甘草中，甘草酸常以铵、钙、钾、铁或铝盐的形式存在。图1-1 甘草酸的分子结构式现代药理学研究表明甘草酸具有抗炎，抗病毒，抗癌以及增强免疫的功能。同时由于其具有糖皮质激素样药理作用而无严重不良反应，临床被广泛用于治疗各种急慢性肝炎、支气管炎和艾滋病，还具有防癌、干扰素诱生剂及细胞免疫调节剂等功能1, 2。此外，甘草酸还具有显著的甜味性能，其甜度约为蔗糖的170倍3。1.2 单葡萄糖醛酸甘草次酸的研究进展单葡萄糖醛酸甘草次酸(glycyrrhetic acid 3-O-

10、mono-D-glucuronide, GAMG)，是甘草酸水解失去一个葡萄糖醛酸基得到，是甘草酸的一个重要衍生物，其分子结构式如图1-2所示。图1-2 甘草酸的酶解示意图单葡萄糖醛酸甘草次酸的制备方法目前GAMG主要是利用微生物由甘草酸水解制备而得到的。而用到的微生物主要有Streptococcus LJ-227和Cryptococcus magnus MG-278。Streptococcus LJ-22是一种从人体内分离出来的细菌。Cryptococcus magnus MG-27是一种从土壤中分离出来的酵母。其中用细菌Streptococcus LJ-22生产GAMG仅是实验室生产规模，

11、未能用于工业生产中。而用酵母Cryptococcus magnus MG-27可以以工业化规模来生产GAMG，并商业化地作为强甜味剂和风味物质使用1.2.2 单葡萄糖醛酸甘草次酸的应用（1） 18-单葡萄糖醛酸甘草次酸的甜味性能1994年日本学者Mizutani9为了研究甘草次酸衍生物的甜度和糖基的关系，化学合成了甘草次酸的几种糖苷，并对它们的甜度进行了评定。研究表明，GAMG的甜度约为蔗糖甜度的941倍，而GL的甜度约为蔗糖甜度的170倍，GAMG是甘草酸甜度的5倍多。GAMG作为GL的衍生物和GL相比，提高了甜度，改善了甜味，同时GAMG具有低热量的特点。作为甜味剂，它的安全性倍受关注。G

12、AMG作为甘草酸的代谢中间体，在鼠和人的肝脏中被分离得到。这说明GAMG和GL在人体内的代谢途径是相同或相似的。作为甜味剂，GAMG比GL更为安全，GAMG的甜度是甘草酸的5倍多，在要达到相同甜度效果的情况下，使用GAMG的量只需要GL量的1/5。GAMG的急性毒性大于5000mg/kg（p. o. in mice），无致畸变作用。总之，功能性、高甜性及天然性成为新一代甜味剂研究开发的重点。最近研究表明，单葡萄糖醛酸甘草次酸作为甜味剂同时具有上述三个特点，因而倍受关注，非常有希望被开发成为食品新资源。（2）GAMG广泛的药理作用10-16GAMG和GL的苷元部分相同，而且GAMG作为甘草酸的代

13、谢中间体，从而应具有和甘草酸、甘草次酸相似的生物活性作用，即“Me-too”。日本丸善化成公司对GAMG的药理进行了详细研究，结构发现GAMG在抗炎活性和抗过敏活性上等同或超过GL，同时发现GAMG具有显著的抗癌作用。抗炎症和抗过敏作用对氨基已糖苷酶(b-hexosaminidase) 释放的抑制作用；对透明质酸酶(hyaluronidase)活性的抑制作用；对氯化间三硝基苯（picryl chloride）诱导的接触性皮炎的抑制作用；对血小板聚集的抑制作用；对角叉菜胶 (carrageein)诱导的爪水肿的抑制作用。抗肿瘤作用GAMG对由4-硝基氧化喹啉/甘油诱导产生的肺癌有非常显著的抑制效

14、果。试验发现，口服GAMG就可以使肿瘤的发生率呈现明显的下降。口服GAMG就可对二乙基亚硝胺/苯巴比妥诱导的肝癌产生抑制作用。研究表明，口服GAMG对原肝癌的发生也有明显的抑制作用。1.3 -葡萄糖醛酸苷酶简介-葡萄糖醛酸苷酶（EC 3.2.1.31），英文名为-D-glucuronidase，以下简称-GUS。-葡萄糖醛酸苷酶是由四个相同亚单位组成的糖蛋白，广泛存在于细菌以及哺乳动物细胞溶酶体中4。-GUS是人体重要的酸性水解酶，参与机体的生理、病理及药物的代谢等过程，能特异的水解葡萄糖醛酸苷键并释放出葡萄糖醛酸和其配基5。由于-GUS的高效专一的水解活性，可作为一种重要的工具酶应用于药物分

15、析领域，如兴奋剂检测中6。目前还有研究将-GUS用于肿瘤的前提药酶导向治疗7。甘草酸是一种三萜皂苷，具有抗病毒、抗炎症、抗肿瘤等药理作用。运用化学和生物手段对其进行分子改造，能显著改善甘草酸的药理作用和甜味性质。药物有效成分在生物体内发生了一系列复杂的生物化学反应，揭示这些外源分子与生物体的相互作用，对于药物的作用机理和新药创制具有积极的意义。而利用生物催化反应的温和性、高效性和专一性，为分子改造开辟了广阔的天地。GL分子中含有一个二糖侧链，-葡萄糖醛酸苷酶能选择性水解该侧链，去除一个或两个糖基。-GUS的分布广范，能催化GL糖基生物转化的-GUS酶主要有以下几种来源：高等动物组织，软体动物的

16、消化液，植物细胞和微生物等。 高等动物组织中的-GUS高等动物组织特别是肝脏中含有丰富的酶，能催化药物或外源性物质的生物转化，使机体免受化学异物的侵害和损伤。同时-GUS还具有糖基转移功能，能催化GL 的糖基水解并转移到毒性物质，形成无毒或低毒的葡萄糖醛酸苷，构成GL药物解毒的基础8, 9。Nakano首先发现GL对大鼠肝脏-GUS水解酚酞基葡萄糖醛酸苷的活性具有抑制作用，而GL被水解成一分子GA和两分子葡萄糖醛酸10。研究表明，肝酶对GL的生物转化是-GUS催化的水解作用。日本学者Akao等对大鼠、牛、猪、人肝脏来源的-GUS的性能进行了研究水解，不同来源的-GUS水解的底物的有所不同11,

17、 12。实验中研究-GUS对18-GL的水解情况，用薄层色谱测定GAMG以及GA的含量，结果表明哺乳动物特别是猪和人肝来源的酶均能水解GL得到GAMG，且对肝-GUS酶活研究发现除人肝外，猪肝酶的活性比其他来源的活性要高。大鼠的各种器官中均含有水解GL或GAMG生成GA的-GUS。这些酶分布于除脑以外的溶酶体中，酶混合物在羟基磷灰石柱层析中洗脱特性有差别，表明存在不同类型的-GUS。表明18-GL的代谢途径有两种：一是-GUS直接水解GL 生成GA，另一种是-GUS水解GL生成GAMG，再由GAMG水解生成GA（图 1-3）13。1.3.2 软体动物消化液中的-GUS软体动物消化液中含有丰富的

18、糖苷酶，催化GL水解的活力强，一般生成GA。Cristol等首先发现GL对玛瑙螺消化液中的-GUS具有非竞争性抑制作用14。Petricic也发现田螺消化液能水解GL的葡萄糖醛酸侧链15 。对蜗牛、帽贝、鲍鱼及海螺等动物消化液中-GUS研究表明，软体动物中一般具有很高的-GUS活性，能水解GL生成两分子葡萄糖醛酸和一分子皂苷元16-18。1.3.3 微生物中的-GUS自然界中存在种类丰富的微生物资源，这些微生物为了适应特定的生存环境，体内含有组成酶或者诱导酶。Iveson在研究生胃酮的代谢过程中发现，大鼠盲肠内容物和胃内容物能水解生胃酮生成GAMG19。为了研究肠道细菌对GL代谢活性，从人的粪

19、便中分离出瘤胃球菌（Ruminococcus PO1-3），能够水解GL生成GA20，之后陆续发现多种能水解GL生成GA的真杆菌、拟杆菌等21, 22。其中人粪便真杆菌（Eubacterium sp. strain GLH）中的-GUS还可以水解酚类化合物的葡萄糖醛酸基。研究证实该-GUS与酚类-D-葡萄糖醛酸苷水解酶、Aspergillus niger GRM3的GL-D-葡萄糖醛酸苷水解酶均有差别23。此外还从真杆菌中得到能专一性水解GAMG而不能水解GL的水解酶24。从肠道菌群中的-GUS对GL糖基部分的水解具有多样性，能将分子中部分或全部糖基水解，转化为易被微生物吸收利用的单糖或二糖，

20、这种生物转化作用对人体药物的吸收、代谢具有重要的意义。曲霉是含有丰富糖苷酶的菌类，在工业生产中广泛的应用。其中黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、酱油曲霉（Aspergillus sojae）等都能将18-GL水解成18-GA25。工业酶制剂也具有催化18-GL糖基转化的能力，NOVOZYMES公司的两种酶制剂VISCOZYME和GAMANASE，水解GL分别生成GAMG和GA26。目前，使用大隐球酵母（Cryptococcus magnus MG-27+）产生的水解酶，已经用于工业化生产GAMG，这种水解酶能特异性水解糖基末端的葡萄糖

21、醛酸，因而不会产生GL27, 28。此外，国内学者如鱼红闪29、王云30分别筛到能定向水解GL生成GAMG的菌种。1.4 固定化技术的研究概况1.4.1 固定化技术的用途及发展前景酶是高效、专一性的生物催化剂。生物体内的各种化学反应都是在酶催化下进行的，但是自由酶在水溶液中很不稳定，可溶性酶一般只能一次性地起催化作用，同时，酶是蛋白质对热、高离子浓度、强酸、强碱及部分有机溶剂等均不够稳定，容易失活而降低其催化能力，这些不足大大限制了酶促反应的广泛应用。自上世纪60 年代出现的固定化酶技术(Immobilized enzyme technology)克服了自由酶的上述不足，使酶可以回收及重复使用

22、，从而成为生物技术中最为活跃的研究领域之一。固定化技术是指将具有化学催化活性的生物催化剂（酶或细胞）进行固定，即定位于一定的空间范围内，实现催化反应。目前，固定化技术的应用已涉及食品、化工、医药等诸多领域31-33。多年来，国内外对固定化技术进行了大量的研究，固定化技术也因此成为当今生物工程中的关键技术之一。但是，国内外在固定化水平上存在着较大差异，国外固定化技术已经应用于工业化生产，且部分固定化酶或细胞的运行周期很长。而国内固定化技术起步晚，采用固定化方法进行生物催化转化的企业为数不多，这是由于传统的固定化技术酶回收率不高，可反应性差，使得许多生物工程产品的生产水平低，成本远高于国外水平，难

23、以与国外竞争。因此，在当今开放和日趋激烈的国际竞争中，加快生物催化剂的固定化技术开发与基础研究，设计和开发新的合成载体材料，利用和改性质优价廉的天然高分子载体材料，探索和研究新的固定化技术，必将对现代工农业生产、现代生物工程、生物医学工程、生物环境工程以及科学技术领域的发展及产业化带来极其重要、深远的影响。1.4.2 固定化的方法酶或细胞的固定化方法可大致分为吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法、微囊法和絮凝法等34，其特性如表 01所示。表 Error! No text of specified style in document.1 固定化方法及其特性的比较 固定方法特性吸附交联包埋共价微囊

24、絮凝制备易易难难难易结合力中偏弱强强强中偏弱弱活性回收率高中中偏低中高高机械保护无有有有弱无空间位阻大大大大大小扩散限制无有有无有无成本低中中高高低稳定性弱强强强中偏弱中偏弱吸附法是指通过载体表面和酶表面间的次级键相互作用而达到酶固定化的方法，根据吸附剂的特点又可分为物理吸附和离子交换吸附。该法具有操作简便、条件温和及吸附剂可反复使用等优点，但也存在吸附力弱，易在不适pH、高盐浓度、高底物浓度及高温条件下解吸脱落的缺点。共价偶联法是将酶的活性非必须侧链基团与载体的功能基通过共价键结合，故表现出良好的稳定性，有利于酶的连续使用，是目前应用和研究最为活跃的一类酶固定化方法，但共价偶联反应容易使酶变

25、性而失活。交联法是利用双功能或多功能基团试剂在酶分子之间交联架桥固定化酶的方法，其更易使酶失活。包埋法包括网格包埋、微囊型包埋和脂质体包埋等，包埋法中因酶本身不参与化学结合反应，故可获得较高的酶活力回收，其缺点是不适用于高分子量底物的传质，且常有扩散限制等问题。目前，如何解决这些问题已经成为固定化技术的研究热点，研究者不断对固定化载体进行改良，并提出新的载体或新的固定化方法，为传统方法注入了新的活力。第2章 材料和方法2.1 试剂和仪器2.1.1 试剂-GUS酶粉实验室自制；甲醇色谱纯上海陆都化学试剂厂冰醋酸分析纯汕头市西陇化工厂水Milipore超纯水卡拉胶食品级石狮狮头琼脂公司海藻酸钠化学

26、纯上海化学试剂厂氯化钾分析纯上海振兴试剂厂氯化钠分析纯上海实验试剂有限公司无水氯化钙分析纯汕头市西陇化工厂氢氧化钠分析纯汕头市西陇化工厂硫酸锰分析纯汕头市西陇化工厂硫酸亚铁分析纯汕头市西陇化工厂硫酸铜分析纯汕头市西陇化工厂氯化钙分析纯上海新宝精细化工厂氯化锌分析纯汕头市西陇化工厂壳聚糖食品级上海利统生物公司明胶化学纯国药集团化学试剂公司聚乙烯醇化学纯国药集团化学试剂公司戊二醛生化试剂国药集团化学试剂公司2.1.2 仪器多用途水浴恒温震荡器DSHZ-300江苏太仓实验设备厂数显恒温水浴锅HH-4常州国华电器有限公司电子天平FA1104N上海天平仪器厂精密pH计PHSJ-3F上海精密科学仪器公司紫

27、外可见分光光度计752型上海棱光技术有限公司高效液相色谱自组装国产系统组织捣碎机DS-1上海标本模型厂2.2 实验方法2.2.1 HPLC含量测定方法(1) HPLC组成高压输液系统：LB-05平流泵（北京卫星制造厂）；检测系统：UVD-680-2紫外检测器（上海金达生化仪器厂），254nm；数据采集及处理系统：N-2000色谱工作站（浙江大学智能信息工程研究所）；进样系统：Rheodyne7725i进样阀（美国Rheodyne公司）。(2) 色谱条件色谱柱：Apollo C18反向色谱柱（美国Alltech公司）；流动相：V(甲醇): V(水) : V(冰醋酸)80: 20: 5；流速：1.

28、0 mL/min；进样量：20 µL；紫外检测器，检测波长：254 nm；柱温：30。2.2.2 -葡萄糖醛酸苷酶活力的测定 将一定量丙酮粉与相同量丙酮粉所得固定化颗粒，分别加入20 mL pH6.0，浓度为10 g/L的18-GL溶液，在50下反应4h。取1 mL反应液，加入装有甲醇的10 mL容量瓶中，将酶灭活，定容至刻度。按照2.2.1节色谱条件，测定18-GAMG的含量，计算固定化颗粒的GAMG转化率和丙酮粉的GAMG转化率的比值，从而得到-葡萄糖醛酸苷酶的相对酶活力。 2.2.3 固定化方法(1) -葡萄糖醛酸苷酶丙酮粉的制备方法取50 g新鲜鸭肝，剔除结缔组织，用组织捣碎

29、机捣碎制成匀浆；用300 mL的冷冻丙酮（-18）将匀浆脱水，抽滤除去丙酮，制备成冷冻丙酮粉；用乙酸乙酯对冷冻丙酮粉进行脱脂处理，于50真空干燥3h，研碎后过100目筛，得到干燥的-葡萄糖醛酸苷酶丙酮粉（-GUS），4冰箱中冷藏备用。(2) 海藻酸钙法配制2%的海藻酸钠胶体溶液10 mL，加入0.2 g -GUS酶粉，混合均匀后，用12号针头滴入冰冷的0.2 mol/L CaCl2溶液中固化3小时，制成直径3 4 mm的球状固定化颗粒，经0.02 mol/L的磷酸缓冲液（pH 7.0）洗涤三次。(3) 明胶法配置10 mL 8%明胶溶液，在40下与0.2 g-GUS酶粉混匀，加入0.5 mL由

30、 50%的戊二醛水溶液和50%乙醇组成的硬化液。混匀后在-20下冷冻3小时后取出，切成3×3×3 mm的颗粒，经0.02 mol/L的磷酸缓冲液（pH 7.0）洗涤后备用。2.2.4 影响固定化酶稳定性的因素(1) 温度对固定化酶稳定性的影响分别取7.0 g固定化酶，分别置于2070的水浴中孵育2 h，滤出固定化酶，蒸馏水洗涤三次后转移至50 mL三角瓶中。分别加入10 g/L 的 GL溶液（pH 6.0）20 mL，于50的水浴中反应12 h。反应结束后，取1 mL转化液，用甲醇稀释定容至10 mL，滤过后检测。(2) pH对固定化酶稳定性的影响分别取7.0 g固定化酶，

31、分别置于pH 3.09.0的缓冲液中，4下静置2 h，滤出固定化酶，蒸馏水洗涤三次后转移至50 mL三角瓶中。分别加入10 g/L 的 GL溶液（pH 6.0）20 mL，于50的水浴中反应12 h。反应结束后，取1 mL转化液，用甲醇稀释定容至10 mL，滤过后检测。(3) 金属离子对固定化酶稳定性的影响取5.0 g 固定化颗粒，分别置于10 g/L不同盐溶液中，4下静置2 h后将固定化酶滤出，蒸馏水洗涤三次后转移至50 mL三角瓶中。加入10 g/L 的 GL溶液（pH 6.0）20 mL，于50的水浴中反应4 h。反应结束后，取1 mL转化液，用甲醇稀释定容至10 mL，滤过后检测。第3

32、章 结果与讨论3.1 -GUS固定化酶的制备3.1.1凝胶包埋体系的选择以明胶、海藻酸钙、海藻酸钙壳聚糖膜以及卡拉胶为不同固定化载体包埋-GUS，实验结果如Error! Reference source not found.所示。四种包埋方法中，海藻酸钙及其壳聚糖膜的包埋方法，不仅酶活较低，机械强度也较差，与一般文献35报道有所差异，这可能是由于酶形态的不同。-GUS酶粉悬浮在海藻酸钠溶液后，滴入CaCl2溶液中，固态的酶粉容易使凝胶破碎，影响凝胶的机械强度，酶从凝胶中泄漏，影响酶的活性。机械强度越大，即在反应中能维持一定的形状，在较高的温度下不会融化。明胶强度一般，但酶活较低。卡拉胶为载体得

33、到的固定化颗粒不易破碎，强度较好，因此目前固定化技术的大规模化一般都采用卡拉胶包埋。同时在-GUS的包埋中，比较几种不同载体，卡拉胶的相对酶活也较高，因而本文选择卡拉胶作为包埋载体，对包埋条件进行优化，得到具有较高酶活、稳定性好的固定化颗粒。此外，在缓冲液存在的条件下，将酶粉研磨得到粗酶液进行包埋的研究表明，-GUS酶溶液易失活，对固定化条件要求较高，工作量大。 酶粉加入量的确定 对卡拉胶固定化酶来说，其转化GL的活性与加入的酶量直接相关由于卡拉胶的通透性良好，加入酶粉的量是固定化酶活性大小的主要因素。因而可以根据实际操作过程确定酶粉的加入量，一般来说，为防止加入的酶粉过多增加酶的泄漏，对于4

34、%浓度的卡拉胶，应该控制酶粉加入量在0.5 g/g 左右（图 3-1）。图 31 酶粉加入量对固定化酶活性的影响3.2 固定化酶的稳定性3.2.1 温度对固定化酶稳定性的影响按照上节方法基本确定了固定化酶的方法，得到了具有较高活性的固定化酶。在pH 6.0的条件下，研究不同温度下固定化酶的稳定性，得到各试验温度下的相对酶活（图3-2）。在2050 温度范围内孵育2 h，对酶活没有明显的影响，相对酶活在8590%的范围内，超过60 固定化酶的活性下降迅速，相对活性仅为10%。图 32 温度对固定化酶活稳定性的影响3.2.2 pH对固定化酶稳定性的影响pH对固定化酶稳定性影响的结果如图3-3所示，

35、从图中可以看出，在pH5.06.0的范围内，酶活较高，低于pH 5.0的条件几乎使酶完全失活；pH 7.0时酶活下降至50%，pH 9.0以上固定化酶也完全失活。pH对固定化酶温定性与酶粉温度性影响相差不大，这可能是由于凝胶的孔径较大，同时-GUS稳定性要求在温和的环境下。图 33 pH对固定化酶活稳定性的影响参考文献1史桂兰, 胡志浩. 甘草酸药理作用及临床应用研究进展J. 天津药学, 2001, 13(1): 1012. 2张剑峰, 张丹参. 甘草酸药理作用的研究进展J. 河北北方学院学报(医学版), 2005, (04):8182. 3Mizutani K, Kuramoto T, Ta

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