Chi和Bar基因双价植物表达载体的构建及转基因烟草的初步检测_图文

1、2010年6月第3期5659甘 肃 农 业 大 学 学 报JO U RN AL O F G AN SU A GR ICU L T U RA L U N IV ERSIT Y 第45卷双月刊Chi 和Bar 基因双价植物表达载体的构建及转基因烟草的初步检测吴文俊, 贾小霞, 张金文, 王汉宁(甘肃农业大学农学院, 甘肃兰州 730070摘要:构建了单子叶植物双价表达载体pBI121 U bi Bar/Chi, 其中含有木霉几丁质酶基因Chi 和抗除草剂B ar 基因, 均由玉米U bi 启动子驱动. 以烟草无菌苗叶片为受体, 用农杆菌介导法将目的基因转入烟草中; 以Bar 基因作为选择标记, P

2、 PT 为选择剂进行筛选, 获得了一定数量的转基因植株. 结果表明:经PCR 分析, 初步确定目的基因已经整合到烟草基因组中.关键词:几丁质酶基因; 抗除草剂基因; 载体构建; 烟草; 转化中图分类号:Q 812 文献标识码:A 文章编号:1003 4315(2010 03 0056 04Construction of plant ex pression vector containing Chi andBar genes and introduction them into tobaccoWU Wen jun, JIA Xiao x ia, ZH AN G Jin w en, WAN G H

3、 an ning(Co llege o f Ag ro no my, Gansu A g ricultur al U niv ersity , L anzhou 730070, ChinaAbstract:M ono coty ledon plant biv alent ex pression v ector w as constr ucted as pBI121 U bi Bar/Chi w hich included T r ichoder ma chitinase gene Chi and resistant herbicide B ar g ene that w ere star te

4、d by Ubi pro moter of m aize. T he target genes w er e transfer red directly to tobacco by A grobacter ium mediated meth o d, and the receptor w as leaf of tobaco aseptic seedling. Some tr ans genetic plants w ere obtained by selec ting w ith the PPT as selecto r, and Bar g ene w as selecting marker

5、. The targ et g enes had been integ rated to to bacco geno me prelim inarily thr ough PCR analy sis.Key words:chitinase g ene; herbicide resistance gene; vector construction; tobacco; transfo rmation 长期以来, 真菌性病害1和杂草危害是造成农作物产量大幅度下降及品质变劣的主要原因, 严重影响着农业生产. 尽管育种工作者在抗病和抗除草剂育种方面做了大量工作, 但由于品种抗性单一、病原菌生理小种变异太

6、快, 使之很快丧失抗病能力, 而传统育种方式存在周期长, 可利用的种质资源匮乏等问题2. 基因工程技术作为一种有效的育种手段, 在作物育种中的应用不但可以有目的地改良其不良性状, 加速育种进程, 而且可使遗传物质的交换突破物种间的界限, 拓宽抗性资源, 可以解决作物抗病育种中由于抗性资源匾乏所造成的抗性不强和难以持久的 瓶颈 问题. 1991年, Brog lie 等3首次将菜豆几丁质酶基因在CaMV 35S 启动子的驱动下, 通过农杆菌介导法将其转人烟草和甘蓝型油莱中, 结果发现, 转基因植物的根、茎、叶中几丁质酶表达量均大幅度提高, 且对立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani 的抗

7、性得到了明显的提高; Saw ahel 等4也用电击法将B ar 基因导入了玉米幼胚中, 获得了抗除草剂玉作者简介:吴文俊(1983 , 男, 硕士研究生, 研究方向为玉米育种. E mail:w uw enju n121163. com 通信作者:王汉宁, 男, 教授, 主要从事作物遗传育种教学及科学研究工作. E mail:w an ghngsau. edu. cn 基金项目:国家科技支撑计划课题(2007BAD52B08 . : :2009 09 06米材料. 因此, 将抗病特性与耐除草剂特性组合起来, 发展具有多种特性的作物育种新资源具有重要意义. 鉴于此, 本试验将木霉几丁质酶基因和

8、抗除草剂B ar 基因6构建在同一植物表达载体上, 并对基因及表达元件进行了设计和修饰, 利用根癌农杆菌介导法将其导入烟草, 获得了转基因植株, 以期为进一步转化玉米、小麦等作物, 培育出兼抗真菌病及抗除草剂的作物种质资源提供理论依据.595&预变性5m in; 94&变性1m in; 65&退火1m in; 72&延伸2min; 循环30次; 72&继续延伸10m in.1. 4 双价植物表达载体的构建酶切、连接和重组质粒转化大肠杆菌以及重组克隆的筛选均按分子克隆实验指南(操作7. 1. 5 双价基因表达载体转化烟草双价基因表达载体转化烟草采用叶盘法8

9、. 1. 6 转基因烟草植株的PCR 鉴定用CT AB 法提取转基因烟草基因组DNA 以1. 5 L 总DNA 为模板进行PCR 扩增.91 材料与方法1. 1 植物材料烟草品种! CV87由甘肃农业大学农学院实验室保存, 取其无菌苗叶片为转化外植体. 1. 2 菌株和质粒大肠杆菌DH 5 , 质粒pEG Chi(含几丁质酶基因 , pBI121, 农杆菌EH A105均为本实验室保存; 质粒pH Ac25(含有Bar 基因 由南京农业大学陈佩度教授馈赠. 1. 3 酶与试剂限制性内切酶, T 4DNA 连接酶, Taq 酶, CI A P 酶, 蛋白酶Q 等均为大连宝生物(TaKaRa 公司

10、产品; 核酸分子量标准为北京天为时代公司产品; LB 培养基所用药品T ry ptone 、Yeast Ex tract 、Sodium Chlo ride 、Ag ar 以及除草剂PPT 等均购于上海Sango n 公司; DNA 回收试剂盒购于北京博大泰克公司.1. 4 PCR 引物及反应体系NOS 终止子引物:上游引物N 1:5# Sma ,2 结果与分析2. 1 双价植物表达载体的构建以质粒pEG Chi 为模板, 用高保真酶, 以引物C 1和引物C 2进行PCR 扩增, 得到1275bp 的Chi 基因, 连接到T 载体上得到T Chi. 以pBI121为模板, 用引物N 1和N 2

11、进行PCR 扩增得到N OS 基因, 连接到T 载体上得到T NOS. 然后用S ma 和Sac 分别酶切T N OS 和pAH C25, 将切下的N OS 终止子片段和载体片段连接得到pAH C25 N os. 用Sma 和Sp e 双酶切pAH C25 Nos 和T Chi, 连接酶切后的目的小片段和载体大片段得到中间载体pAH C25 Chi. 用E co R 和Bam H 双酶切pBI121和pAH C25分别回收载体大片段和868bp 目的片段(包括B ar 基因和NOS 终止子 , 两者连接得到重组质粒pBI121 Bar. 用Bam H 和H ind%双酶切pBI121 Ba 和

12、H ind %Bam H %pAH C25, 分别回收载体大片段和包括U bi 启动子的目的小片段, 两者连接得到重组质粒pBI121 U bi Bar. 用H ind %单酶切质粒pBI121 U bi Bar 开环, 并用CI AP 酶进行去磷酸化处理, 以防止载体自连. 将回收得到的完整Chi 基因表达盒与开环的pBI121 U bi Bar 采用T 4DNA 连接酶进行连接, 最终得到双价植物表达载体pBI121 U bi Bar/Chi (图1.2. 2 构建过程中各重组质粒的鉴定2. 2. 1 Chi 基因的PCR 扩增 以pEG Chi 质粒为模板, 用引物C 1和C 2扩增出大

13、小为1275bp 的Eco O65GAAT TT CCCCGATCGT 3#; 下游引物N 2:5# GCGGA GCT C Sac Bam H H indSp e GAAT TCCCGAT CTAGT AACA 3#; 扩增反应条件:95&预变性5min; 94&变性1min; 65&退火1min; 72&延伸2min; 循环30次; 72&继续延伸10min.Chi 基因引物:上游引物C 1:5# NcoSmaEco O65ATGT T Bam H GGGT T TCCTCGGAAA ATCC 3#; 下游引物C 2:5# Hind %GTT GA

14、G3: 图1 载体pBI121 Ubi Bar/Chi 结构图Fig. 1 Str ucture o f plasmid pBI121 U bi Bar/ Chi注:M. 核酸标准分子量; 1. PCR 产物.图2 Chi 基因的PCR 扩增F ig. 2 A mplification o f chit inase g ene by P CR注:M. 核酸标准分子量; 1. pBI121 Ubi Bar 双酶切产物.2. 2. 2 重组质粒pBI121 35S Bar 的酶切鉴定 将pBI121 35S Bar 质粒进行Bam H 、E co R 双酶切鉴定, 结果酶切产生1条约800bp 大

15、小的片段, 与预期片段大小相符(图3 .图4 重组质粒pBI121 Ubi Bar 的酶切鉴定Fig. 4 Identif ication of pBI121 35S Bar by restr ictionenzymes digestio n2. 2. 4 重组质粒pAH C25 NOS 的PCR 扩增及酶切鉴定 用S ma 和S p e 双切重组质粒pAH C 25 Nos, 经1%琼脂糖凝胶电泳, 观察到大小约为300bp 的特异带, 与PCR 结果一致, 大小与预期的相符(图5 , 说明重组质粒pAH C25 N os 已成功构建 .注:M. 核酸标准分子量; 1. pBI121 35S

16、 Bar 双酶切产物.图3 重组质粒pBI121 35S Bar 的酶切鉴定F ig. 3 Ident ificatio n o f pBI121 35S Bar by r est rictionenzy mes dig estion2. 2. 3 重组质粒pBI121 U bi Bar 的酶切鉴定 将pBI121 Ubi Bar 质粒进行Bam H 、H ind %双酶切鉴定, 结果酶切产生1条约2000bp 大小的片段, 与预期片段大小相符(图4 , 表明植物表达载体pBI121已改造成功 .注:M. 核酸标准分子量; 1. pAH C25 NOS 双酶切产物; 2. PCR 产物.图5

17、pAHC25 NOS 的PCR 扩增及酶切鉴定Fig. 5 Identificatio n o f pA H C25 N O S by restr iction2. 2. 5 重组质粒pAH C25 Chi 的PCR 扩增及酶切鉴定 用S ma 和S p e 双酶切重组质粒pAH C 25 Chi, 经1%琼脂糖凝胶电泳, 观察到大小约为1000bp 的特异带, 与PCR 结果一致, 大小与预期的相符(图6 , 说明重组质粒pAH C25 Chi 已成功构建 .2. 3 双价植物表达载体导入烟草及转基因烟草的PC R 检测将双价载体用冻融法转入根癌农杆菌EH A105, 叶盘法转化烟草, 用5

18、mg L -1PPT (除草剂 筛选共获得再生烟草植株60株. 取60株转pBI121 U bi Bar/Chi 基因烟草植株叶片基因组DNA 进行Chi 基因的PCR 检测, 有56株呈现阳性, 初步证明Chi 和B ar 基因已经整合进烟草基因组中(图8.注:M . 核酸标准分子量; 1 3, 5 9. 转基因植株; 4. 阴性注:M. 核酸标准分子量; 1. PCR 产物; 2. pAHC25Ch i 双酶切产物.对照(未转基因植株 .图8 转基因烟草PCR 分析F ig. 8 P CR analysis o f transgenic tobacco plants图6 重组质粒pA HC

19、 25 Chi 的PCR 扩增及酶切鉴定Fig. 6 Ident ificatio n o f pA H C25 Chi by restrict ionenzy mes dig estion and P CR test3 讨论与结论病害和草害是制约农业生产的一个重要的限制性因素, 因此, 病害和草害的研究和防治一直是一个重要的课题, 利用现代生物技术寻找广谱而有效的抗病和抗除草剂的转基因组合是切实可行的. 近年来, 除草剂抗性基因中研究应用较多的是B ar 基因, 它的表达产物可以提供对草丁膦(PPT 类除草剂的抗性, 用含相应有效成分的除草剂进行筛选可以收到较为明显的效果, 所以抗除草剂基因

20、既可作为目的基因, 又可作为筛选基因.本试验构建的植物表达载体是采用了已证明在转基因玉米、水稻、小麦中具有较高的活性的Ubi 启动子, Chi 基因已被证明对立枯丝核菌具有良好的抗性, 所以, 实验中所构建的带有Chi 和Bar 基因的双价植物表达载体pBI121 Ubi Bar/Chi, 既针对了真菌性病害, 又可以降低在农业生产中除草所费的大量人力和财力, 并且已经进行了转烟草实验, 获得了阳性植株, 检测阳性率高达90%, 因而为该实用载体的进一步广泛应用打下了基础, 希望借此获得抗病和抗除草剂的转基因植物材料.页2. 2. 6 重组质粒pBI121 Ubi Bar /Chi 的PCR

21、扩增及酶切鉴定 用Sm a 和Sp e 双切重组质粒pBI121 Ubi Bar/Chi, 经1%琼脂糖凝胶电泳, 观察到大小约为1200bp 的特异带, 与PCR 结果一致, 大小与预期的相符(图7 , 说明载体pBI121 Ubi Bar/Chi 已成功构建 .注:M. 核酸标准分子量; 1. pBI121 U bi Bar/Chi双酶切产物; 2. PCR 产物.图7 重组质粒pBI121 Ubi Bar/Chi 的酶切鉴定Fig. 7 Ident ificatio n o f pBI121 U bi Bar by restrict ion Land Reclamatio n M ini

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