Fas和FasL在急性胰腺炎中的共表达及其与凋亡的关系J

1、Fas和FasL在急性胰腺炎中的共表达及其与凋亡的关系 作者：李震东1；马清涌1；徐军1；李明2(西安交通大学1第一医院肝胆外科，2医学院组胚教研室，陕西西安710061)摘要：目的探讨凋亡调控基因Fas、FasL在大鼠急性胰腺炎中的表达及其与腺泡细胞凋亡的关系。方法通过胰胆管内逆行注射不同浓度的牛磺胆酸钠，建立不同严重程度的急性胰腺炎模型，用RT-PCR、免疫组化法检测胰腺组织Fas、FasL mRNA及蛋白的表达，原位末端标记法检测各组大鼠胰腺腺泡细胞凋亡。结果在正常的胰腺腺泡细胞中即存在着Fas、FasL mRNA及蛋白的表达，且呈现共区域化特点，凋亡细胞极少。在炎症程度较轻的胰腺组织，

2、Fas和FasL mRNA的表达水平显著提高，腺泡细胞凋亡指数亦明显提高，随胰腺炎症程度的加重，Fas和FasL mRNA的表达逐渐下降，腺泡细胞凋亡指数亦逐渐下降。结论Fas/FasL系统可能参与了正常胰腺组织的细胞更新和自稳；是介导急性胰腺炎时腺泡细胞凋亡的一个重要途径。关键词：急性胰腺炎；细胞凋亡；Fas；FasL中图分类号：R657.5文献标识码：A文章编号：1673-4254(2006)01-0025-05Colocalized expression of Fas and Fas-Ligand in acute pancreatitis and its correlation wit

3、h cell apoptosisLI Zhen-dong1；MA Qing-yong1；XU Jun1；LI Ming2Department of Hepatobiliary Surgery, First Hospital of Xian Jiaotong University1, Department of Histoembryology, Medical College2, Xian Jiaotong University, Xian 710061, ChinaAbstract: Objective To study the expressions of Fas and Fas-Ligan

4、d (FasL) genes in rats with acute pancreatitis (AP) and their relation to apoptosis of pancreatic acinar cells. Methods Rat models of acute pancreatitis with varied severity were established by retrograde injection of sodium taurocholate at different concentrations via the apancreatobiliary duct. Th

5、e expressions of Fas and FasL mRNAs and proteins were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemistry. The apoptosis of acinar cells was quantified by in situ nick ending-labeling technique. Results of expressions fas, FasL mRNA and protein were colocali

6、zed in normal pancreatic acinar cells. In pancreatic tissue with less severe inflammation, the expressions of Fas and FasL mRNA increased significantly, and the apoptosis index of the acinar cells was also elevated; with the increase in the severity of the pancreatitis, the expression of Fas and Fas

7、L mRNAs were gradually lowered and apoptosis index of the acinar cells was increased. ConclusionFas/FasL system might be involved in the renewal and homeostasis of normal pancreatic tissue, and constitute an important pathway mediating the apoptosis of pancreatic acinar cells in AP .Key words: acute

8、 pancreatitis; apoptosis; Fas; FasL收稿日期：2005-08-16基金项目：国家自然科学基金(30371398)Supported by National Natural Science Foundation of China(30371398)作者简介：李震东(1969-)，男，外科主治医师，博士研究生，电话E-mail: victor7922通讯作者：马清涌，教授，博士生导师，电话E-mail：qyma0 近年来在多种急性胰腺炎动物模型中的研究发现，胰腺腺泡细胞凋亡程度与急性胰腺炎胰腺炎症的严重度呈负

9、相关性，诱导凋亡可明显减轻急性胰腺炎病情1。Fas/FasL系统是许多疾病如肝炎和自身免疫性疾病等的细胞凋亡介质，Fas(CD95)是肿瘤坏死因子(TNF)受体家族I型跨膜蛋白及FasL的受体，相对分子质量45 000； FasL是TNF家族型跨膜蛋白，相对分子质量40 000，Fas与其配体FasL或Fas抗体结合可诱导Fas表达细胞发生凋亡。但其在急性胰腺炎中的重要性尚未阐明，本文对此加以探讨。1材料和方法1.1药物与试剂牛磺胆酸钠购自Sigma公司，使用前以生理盐水配制成不同质量浓度的溶液。总RNA提取试剂盒(TRI试剂)购自美国MRC公司，RNA反转录试剂盒及PCR试剂盒购自Ferme

10、ntas公司，Fas、FasL多克隆抗体购自武汉博士德生物制品有限公司，TUNEL法细胞原位凋亡检测试剂盒购自德国Roche公司。1.2实验动物分组与模型制备将40只SD雄性大鼠(购自西安交通大学医学院实验动物中心，体质量250300 g)随机分成4组，每组10只， 经十二指肠壁潜行穿刺胆胰管注射牛磺胆酸钠以诱导急性胰腺炎(AP)。其中A组为假手术对照组，仅行剖腹探查，牵引胰腺后关腹；B、C、D组为AP模型组，分别给予2.0%、3.5%、5.0%牛磺胆酸钠0.1 ml/100 g体质量，建立不同炎症程度的AP模型。术后6 h处死大鼠，快速切取胰尾部组织液氮保存备RNA提取，取病变较为一致的胰头

11、部组织置4% PBS多聚甲醛中固定，4 m连续切片供HE染色及免疫组化研究。1.3胰腺组织病理损害评分常规制作胰腺病理HE切片，镜下比较胰腺病理组织学改变，采用Schmidt2的胰腺组织学改变评分系统，由专人盲法在光镜下按照水肿、腺泡细胞坏死、出血和脂肪坏死、炎症和血管周围浸润程度不同分04分评分。1.4RT-PCR法检测胰腺组织Fas、FasL mRNA的表达用TRI试剂提取胰腺组织总RNA，将5 g总RNA反转录后行PCR。PCR扩增体系25 l，其中含2PCR master mix 12.5 l，上、下游引物各0.75 l，cDNA模板(逆转录产物)1 l，以PTC-200型(MJ公司，

12、美国)PCR仪作热循环：预变性94 3 min；循环：94 45 s、60 45 s、72 45 s、共35循环。循环结束后72 10 min。Fas、FasL及内参GAPDH引物由大连宝生物工程公司合成，引物序列如下：Fas 上游：5GATATGCTGTGGATCAT GGC 3，下游：5AACTTTTCGTTCACCAG 3(201 bp，下同)；FasL 上游：5ATGGAACTG CTTTGATCTCTGG 3，下游：5AGATTCCTCAAAA TTGATCAGAG 3(320 bp)； GAPDH 上游：5CATAG ACAAGATGGTGAAGG3，下游：5TCCACAGTCTT

13、 CTGAGTGGC 3(570 bp)。取PCR产物各5 l在1.0%琼脂糖凝胶中电泳(150 V恒压电泳0.5 h)，应用Gel-Doc2000型全自动凝胶成像分析仪(Boi-Rad公司，美国)照相并测定每条带的光密度值，以GAPDH的表达量为内对照计算并比较各组样本Fas、FasL的相对表达量。1.5胰腺组织Fas、FasL免疫组化检测兔抗大鼠Fas、FasL多克隆抗体，工作浓度均为1200。免疫组化操作过程按试剂盒说明书进行，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片，光镜观察。1.6胰腺组织凋亡检测采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)。操作严格按照说明书进行

14、。以双蒸水代替TDT作阴性对照，DNAase 处理的切片作阳性对照。根据染色结果于每张切片中选取10个高倍视野(400)，计数1000个胰腺腺泡细胞中的阳性细胞数，计算凋亡指数(即每100个细胞中TUNEL阳性细胞所占的百分比)。1.7统计方法数据以(s)表示，以SPSS10.0软件包进行统计。采用单因素方差分析计算各组间差异，检验水准=0.05为差异有显著性。2结果2.1光镜下胰腺组织学改变及病理评分对照组胰腺在光镜下无异常或仅有轻度水肿；在造模后的B组，可见大鼠胰腺间质水肿，小叶和腺泡间隙增宽，伴多量中性粒细胞及少量淋巴细胞浸润，胰腺实质内可见点片状出血和坏死，在牛磺胆酸钠浓度逐渐增大的C

15、、D两组，上述表现更加明显，伴小叶结构破坏，细胞轮廊不清，胰腺坏死周围小血管扩张、红细胞淤积并微血栓形成(表1)。 2.2Fas和FasLmRNA在正常胰腺及AP胰腺组织中的表达RT-PCR结果显示，正常胰腺组织即有Fas和FasL mRNA的转录表达，在AP炎症程度较轻的B组，Fas和FasL mRNA的转录水平显著增高，在AP模型C、D两组，随胰腺组织炎症程度的加重，Fas和FasL mRNA的表达水平逐渐下降。且Fas 表达水平在各个组间的变化趋势与FasL 的变化趋势相一致(图1，2)。 图1Fas mRNA (A)和FasL mRNA (B)在正常和AP胰腺组织中的RT-PCR凝胶电

16、泳图Fig.1Fas mRNA(A) and Fas Ligand mRNA(B) expression detected by RT-PCR in normal and acute inflammatory pancreasLanes 1-4: Fas (201bp) and FasL (320 bp); Lanes 5-8: GAPDH (570 bp); Lanes 1,5: Group A;Lanes 2, 6: Group B;Lanes 3, 7: Group C; Lanes 4, 8: Group D图2Fas mRNA (A)和FasL mRNA (B)在正常和AP各胰腺组织

17、中的RT-PCR半定量分析Fig.2Changes of Fas mRNA (A)and Fas Ligand mRNA(B) expression analyzed by semiquantitative RT-PCR inthe pancreas of normal and acute inflammatory ratsaP0.05 vs control group,; bP0.05 compared within AP groups. A, B, C, D: Groups A, B, C and D respectively2.3胰腺组织Fas、FasL蛋白表达定位在正常胰腺组织中，Fa

18、s和FasL呈弱阳性表达，胞质染成棕黄色，FasL也有少量胞膜着色，见于几乎所有的腺泡细胞。连续切片分析显示Fas和FasL共同表达于腺泡细胞质内，在AP模型B组，Fas和FasL表达明显增强，以炎症浸润区和腺泡细胞坏死区最为显著。随胰腺炎症程度的加重，Fas、FasL的表达逐渐减弱。另外，Fas和FasL也表达于正常的胰岛细胞、血管内皮细胞，而胰腺导管上皮细胞、胰腺炎时浸润的中性粒细胞内均不表达(图3)。 图3连续切片免疫组化检测正常及不同炎症程度胰腺组织Fas、FasL蛋白表达定位Fig.3Immunohistochemistry of serial sections of normal

19、and inflammatory rat pancreas showing the expressions of Fas and FasL proteins (Originalmagnification: 200)A, B, C, D: Groups A, B, C and D respectively2.4TUNEL法检测各组胰腺细胞凋亡情况比较细胞凋亡阳性结果表现为胞核染成棕褐色，胞核固缩、空泡化，染色质浓缩、边聚，凋亡小体形成。结果可见正常组胰腺腺泡细胞凋亡极少(图4A)，建立AP模型后, B组胰腺炎程度较轻，凋亡细胞多见(图4B)，C组病理改变较B组加重，凋亡细胞较多见(图4C)，D组

20、为重度出血坏死性胰腺炎，凋亡细胞少见(图4D)。经统计学处理各组胰腺细胞凋亡指数，各AP模型组与对照组凋亡指数相比(P0.01)，各AP模型组间比较(P0.01)，差异显著。 图4TUNEL原位末端标记法检测各组大鼠胰腺细胞凋亡Fig.4In situ detection of apoptosis by terminal transferase mediated nick end labeling (TUNEL) showing brown and shrunk nuclei of the apoptotic cells with vacuolization, chromatin conden

21、sation, and formation of apoptotic bodies (Original magnification:400)A, B, C, D: Groups A, B, C and D respectively3讨论Fas/FasL系统是细胞凋亡最主要的途径之一，Fas单抗诱导肿瘤细胞凋亡已被大量实验证实3。FasL和Fas结合后，首先使Fas形成能传递信号的活性三聚体， 并将凋亡信号向胞内传递、激活一系列被称为Caspase的半胱氨酸蛋白酶，完成细胞凋亡过程。有研究发现45，Fas/FasL凋亡通道介导了急性胰腺炎腺泡细胞凋亡，Fas基因缺失可明显加重蛙皮素诱导的鼠急性胰

22、腺炎病情，提示Fas凋亡通路在急性胰腺炎中扮演着重要的角色。我们的研究发现，在正常的胰腺腺泡细胞中即存在着Fas和FasLmRNA及蛋白的表达，且呈现共区域化特点，这同Kornmann 等6的研究结果是一致的。Fas/FasL的共区域化表达同样存在于胸腺、食管上皮78等组织中。提示正常组织的生理性细胞更新可能受Fas/FasL系统自分泌或旁分泌凋亡通路的调节。越来越多的证据表明Fas与FasL的相互作用有助于组织自稳，如阴道上皮、肝脏和睾丸8。虽然Fas与FasL的共表达可能介导胰腺细胞凋亡，但Natoli 等9研究发现Fas/FasL系统的表达并不必然引起表达细胞的凋亡，Fas/FasL凋亡

23、通道的启动尚需要协同刺激信号的存在。另外，凋亡是一个由多因素控制的精细过程，多种凋亡通路共同存在，保证了表达组织的自稳和对外来刺激的适度反应。在本研究中，我们通过经胰胆管逆行注射不同浓度的牛磺胆酸钠建立炎症程度不一的AP模型，用TUNEL法检测各组胰腺腺泡细胞凋亡率的变化，利用RT-PCR技术进一步检测了凋亡调控基因Fas和FasL mRNA的表达。我们发现，正常胰腺组织腺泡细胞凋亡率很低，建立AP模型后，在炎症程度较轻的B组，腺泡细胞凋亡率明显升高，Fas和FasL mRNA的表达水平亦随之显著升高；随胰腺炎症程度的加重，腺泡细胞凋亡率逐渐下降，Fas和FasL mRNA的表达亦逐渐下降。这

24、一结果再次证实在急性胰腺炎过程中，腺泡细胞凋亡与急性胰腺炎的严重程度呈负相关关系，腺泡细胞凋亡是对胰腺炎本身的一种保护性反应。胰腺腺泡细胞凋亡至少部分是由Fas/FasL系统介导而实现的，Fas/FasL系统是介导胰腺炎细胞凋亡的重要途径之一。总之，我们的研究证实了Fas及FasL在正常胰腺细胞中呈共区域化表达及其与腺泡细胞凋亡的关系。这一结果表明，Fas/FasL系统可能参与了正常胰腺组织的自稳和细胞更新；Fas/FasL系统可能是急性胰腺炎病程中介导凋亡的一个重要通路，通过Fas/FasL系统诱导凋亡可以减轻急性胰腺炎病情。有关Fas/FasL通路调节凋亡的确切机制尚须进一步研究。参考文献

25、：1Bhatia M. Apoptosis of pancreatic acinar cells in acute pancreatitis: is it good or badJ? J Cell Mol Med, 2004,8(3): 402-409.2Schmidt J, Rattner DW, Lewandrowski K, et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapyJ. Ann Surg, 1992, 215: 44-56.3Roskams T, Libbrecht L, van Damme B,

26、 et al. Fas and Fas ligand: strong co-expression in human hepatocytes surrounding hepato- cellular carcinoma; can cancer induce suicide in peritumoural cellsJ? J Pathol, 2000, 191(2):150-53.4Yasuda H, Kataoka K, Ichimura H, et al. Cytokine expression and induction of acinar cell apoptosis after panc