乙醇脱氢酶I基因敲除的酿酒酵母重组菌 构建的初步研究

1、2008, Vol. 29, No. 02食品科学生物工程210收稿日期:2007-01-15基金项目:黑龙江省科学技术厅青年基金项目(QCO4C33;黑龙江省教育厅一般项目(10551233;黑龙江大学青年基金项目(QL200435作者简介:葛菁萍(1972-,女,教授,博士,研究方向微生物学。E-mail:gejingping512 *通讯作者:平文祥(1959-,男,教授,学士,研究方向微生物学。E-mail:wenxiangp乙醇脱氢酶I基因敲除的酿酒酵母重组菌构建的初步研究葛菁萍,宋刚,孙宗祥,凌宏志,蔡柏岩,刘松梅,平文祥*(黑龙江大学微生物黑龙江省高校重点实验室,黑龙江哈尔滨15

2、0080摘要:本实验根据酿酒酵母乙醇代谢途径,构建一株低乙醇产量的酿酒酵母基因工程菌株,以满足人们对低醇啤酒的需要。利用抗性基因筛选基因敲除突变体的方法,通过引物L 1和L2扩增潮霉素B 基因(两翼与酿酒酵母同源,按常规醋酸锂法转化酵母细胞后,筛选标记与酵母adh I 基因发生同源重组,得到一株ADHI 酶活性降低的工程菌株。发酵实验结果表明,转化菌株乙醇含量平均值为1.8%(V/V,较原始菌株低了65%。说明转化菌株体内乙醇生成途径受到干扰。关键词:酿酒酵母;基因敲除;乙醇脱氢酶IPreliminaryStudyonDeletionofSaccharomycescerevisiae Alco

3、holDehydrogeniaseIGeneGEJing-ping,SONGGang,SUNZong-xiang,LINGHong-zhi,CAIBai-yan,LIUSong-mei,PINGWen-xiang*(HeilongjiangKeyLaboratoryofMicrobiology,CollegeofLifeScience,HeilongjiangUniversity,Harbin150080,ChinaAbstract :Themainpurposeofthisresearchistoconstructalowalcoholproducingstrainaccordingtoth

4、ealcoholmetabolic pathwayofSaccharomycescerevisiae ,soastosatisfythepeoplewhoprefertodrinklow-alcoholbeer.HygromycinBresistant genewasusedtoscreenmutantswithadh Igeneknockedout.AfterHygromycinBresistantgenewasamplifiedwithprimers L1andL2(theflankingfragmentswerecomplementwithSaccharomycescerevisiae

5、gene,itwastransformedintoyeastHDY-01byLiAcmethodandthealcoholdehydrogenaseI(ADHIinSaccharomycescerevisiaewasdeletedthroughhomologous recombination.AtransformantwasobtainedwithlowADHIactivity.Thefermentationtestsshowedthattheaveragealcohol contentofthetransformantis1.8%(V/V,65%lowerthantheoriginone.T

6、healcoholmetabolicpathwayinthistransformant is interfered.Keywords :Saccharomycescerevisiae ;genedeletion ;alcoholdehydrogenaseI(ADHI中图分类号:TS2625文献标识码:A文章编号:1002-6630(200802-0210-03啤酒是以麦芽为主要原料,添加酒花,经酵母发酵酿制而成的,是一种含二氧化碳、起泡和低酒精度的饮料酒1。其酒精的含量一般为3%4%(V/V。随着人们生活水平的提高及口味的多样化,低醇乃至无醇啤酒成为部分消费人群的首选。目前,世界上生产无醇啤酒

7、的方法主要有二大类2:一是以限制发酵方法来降低制酒发酵过程中生成乙醇的量;另一类是在后发酵过程中将产生的乙醇除去。随着基因工程技术的快速发展,以及对酿酒酵母基因的深入研究,从代谢途径出发,构建低乙醇产量的酿酒酵母基因工程菌株,可在不改变原有啤酒工艺的基础上,实现低醇乃至无醇啤酒的生产。但目前有关这方面的研究报道几乎未见到。从酵母代谢途径可知,控制乙醇含量的两个酶是乙醇脱氢酶I(ADHI与乙醇脱氢酶II(ADHII。ADHI 的作用是将乙醛变成乙醇,ADH II 的作用是将乙醇转变为乙醛3。本实验利用抗性基因筛选基因敲除突变体的方法4,通过PCR 技术获得一段带有筛选标记和酵母同源区域的目的基因

8、,通过常规醋酸锂转化法,使筛选标记与酵母adhI 基因发生同源重组,得到一株ADHI 酶活性降低的工程菌株。1材料与方法1.1菌种与质粒211生物工程食品科学2008, Vol. 29, No. 02H D Y-01是一株工业用酿酒酵母,用于啤酒生产。由黑龙江大学微生物重点实验室提供。质粒pCAMBIA1301是一种穿梭质粒,在大肠杆菌中对卡那霉素(kanamycin有抗性,在酵母菌中对潮霉素B(hygromycinB有抗性。1.2培养基与试剂Y P D培养基:1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖,115灭菌20min,用于酵母菌的活化和培养。麦芽汁培养基:麦芽和水以1:4的比例混合后,60

9、水浴4h,8层纱布过滤,滤出液108灭菌20min,待用。用于酵母菌发酵培养实验。氯化钙、氯化镁、PEG4000(聚乙二醇、醋酸锂、乙酸铵、琼脂糖、酵母提取物、蛋白胨、T r i s、盐酸等,均为国产试剂;鲑精D N A(S i g m a、潮霉素(MDBIO、Tag酶、dNTP天为时代公司。1.3引物引物由上海生工合成。为了敲除A D H I基因,设计了一对引物L1和L2。此对引物依据酿酒酵母ADHI 基因全序列(1042bp和pCAMBIA1301质粒中潮霉素B基因而设计的。酿酒酵母ADHI基因的序列通过网站http:/ //查询。L1和L2以pCAM

10、BIA1301上的潮霉素B基因为模板,扩增后的D N A片段转入酿酒酵母后实现同源重组。L1和L2的5'端各有45bp与酿酒酵母ADHI基因外侧序列相同。在3'端,L1的22bp和L2的21bp与潮霉素B基因两侧序列相同。用L1和L2扩增的D N A片段与ADHI基因同源重组,使ADHI基因失去作用。同时由于替换的基因对潮霉素B有抗性,因此成为抗性标记,行使筛选任务。为了验证转化后的酵母菌是否含有目的片段,我们设计了H y B1和H y B2引物,这对引物可以扩增出潮霉素基因片段。L1:5'TTTCAAGCTATACCAAGCATACAATCA ACTATCTCATAT

11、ACAATGATGAAAAAGCCTGAA CTCACCG3'L2:5'AACTTATTTAATAATAAAAATCAT AAATCATAAGAAATTCGCTTACTATTTCTTTGC CCTCGGACG3'HyB1:5'CAATGATGAAAAAGCCTGAACTC ACCG3'HyB2:5'GCTTACTATTTCTTTGCCCTCGG ACG3'1.4方法1.4.1潮霉素最低杀伤浓度的确定由于野生酵母菌对潮霉素不具有抗性。所以用潮霉素作为筛选抗性标记,因此需要检测被转化酵母菌对潮霉素的最低耐受浓度。取一系列浓度的潮霉素溶液0.2

12、ml (25、50、75、100、125g/ml均匀涂布于YPD平板上,待溶液渗入培养基后,将预先过夜培养的酵母菌液0.2ml均匀涂布于各平板上,30培养48h后观察酵母菌生长情况,以能杀死全部酵母菌的最低潮霉素浓度作为筛选浓度。1.4.2PCR扩增转化片段以L1和L2为引物,以质粒p C A M B I A1301为模板进行P C R扩增。P C R反应体系为:10×P C R缓冲液1l,2.5dNTP0.8l,L1和L2(1pmol/l各1l, pCAMBIA1301质粒DNA2l,25mmol/LMgCl20.8l, Tag酶(5U/l0.2l,加双蒸水至10l。P C R反应

13、程序为:94预变性5m i n;94变性30s,59退火30s,72延伸1.5min,35个循环;最后72延伸7min;4保存样品。以1%琼脂糖凝胶电泳检测。1.4.3转化醋酸锂转化法转化酵母菌D N A5。1.4.4筛选潮霉素抗性酵母菌株转化后的酵母菌液涂布到含有潮霉素的YPD平板上, 30培养48h后,将生长出的酵母菌落视为阳性菌落。1.4.5重组菌落的验证从含潮霉素的平板上挑取较大的单菌落,接种于含有潮霉素的YPD液体培养基中,30,180r/min培养48h,收集细胞,利用酵母基因组提取试剂盒(天为时代提取酵母基因组DNA。以它为模板,利用HyB1和HyB2为引物做PCR扩增验证。PC

14、R反应条件及程序同1.4.2。1.4.6发酵实验证明以3%接种量,分别将原始酵母菌株和突变酵母菌株接入麦芽汁液体培养基中,以满瓶为装液量(700ml, 12静止发酵510d,利用Agilent6890气相色谱、FID 检测器(氢火焰离子化检测器、7694E顶空进样器、Agilent6890气相色谱化学工作站检测乙醛含量。利用气相色谱测定其中乙醇含量。2结果与分析2.1潮霉素最低杀伤浓度野生酿酒酵母菌株对潮霉素不具有抗性,但是需要一定浓度的潮霉素才可以将酵母菌全部杀死。本实验验证了25、50、75、100、125g/ml系列潮霉素浓度对酵母菌的杀伤作用,发现当潮霉素浓度为100g/ml时(图1D

15、,可以将酵母菌全部杀死。2.2转化片段的获得以L1和L2为引物,以质粒pCAMBIA1301为模板进行P C R扩增,获得转化目的片段,经过电泳检测,其片段长度为1116bp(图2。2.3突变菌株的验证利用醋酸锂转化法,直接将2.2中的P C R产物转化进入HDY-01酵母菌中,在100g/ml潮霉素平板上2008, Vol. 29, No. 02食品科学生物工程212筛选抗性菌落。结果显示(图3,有部分菌株可以在含 有潮霉素的平板上生长,表明其体内含有潮霉素抗性,而在空白对照平板上(未涂有100g/ml 潮霉素没有菌落生成。利用酵母基因组提取试剂盒,提取转化后酵母及野生酵母的基因组D N A

16、,以H y B 1和H y B 2引物进行P C R 扩增。结果发现(图4,在酵母基因组上,扩增出本实验所需要的片段1026bp,说明外源基因已经整合到酵母基因组上。2.5发酵实验将野生菌株和转化菌株经过发酵后,通过检测其中的乙醛和乙醇含量,确定ADHI 基因被敲除的情况。初步研究结果表明,发酵5d 时,原始菌株的乙醛含量为0.466mg/L,而转化子的乙醛含量平均值为0.550mg/L,均小于成熟优质啤酒中乙醛含量(38mg/L6,说明转化子中乙醛含量是合格的。原始菌株的乙醇含量为5.1%(V/V,而转化子的乙醇含量平均值为1.8%(V/V,较原始菌株低了65%,说明转化菌株体内乙醇生成途经

17、受到干扰。虽然经PCR 验证潮霉素基因已经整合到野生菌株体内,但是其是否完全取代ADHI 还需要进一步验证。从啤酒厂发酵生产啤酒的工艺角度来看,发酵5d 时,正是各项检测指标值比较高的时期,尤其是乙醛含量,这说明,本实验通过基因敲除得到的转化子可以满足工厂发酵的需要。参考文献: 1严加伟.啤酒百科M.北京:航空工业出版社,1993.2菜会英,王进,张伟.无醇啤酒的研制开发J.酿酒,2001(1:49.3赵丽娟,王德良,程玉来,等.利用基因敲除技术破坏酿酒酵母乙醇脱氢酶II基因的初步研究J.食品与发酵工业,2005,31(11:30-33.4张延平,刘铭,曹竹安.醛脱氢酶基因敲除的K.pneum

18、 重组菌的构建J.中国生物工程杂志,2005,25(12:34-38.5萨姆布鲁克J,拉塞尔DW.分子克隆实验指南M.3版.黄培堂,等译.北京:科学出版社,2002.6葛邦国,王德良,傅力,等.啤酒酵母中乙醇脱氢酶I的扩增与表达J.农产品加工:学刊,2005(8:24-27.图D 所示,100g /m l 时,酿酒酵母没有生长。图1潮霉素最低杀伤浓度图Fig.1 Minimum inhibitory concentration of Hygromycin to yeast100g/ml CD 75g/ml 125g/mlE25g/ml A 50g/ml B M 为分子量标准(DL2000,天为时代;泳道1和2均为所扩增的样品,其分子量为1116bp。图2PCR 扩增潮霉素基因片段图Fig.2 Amplified DNA fragment of hygromycin gene usingPCR2000bp M121116bp1000bp转化A B空白抗性菌落A 为空白对照,涂布有野生酵母H D Y