Caspase家族与细胞凋亡

1、Caspase家族与细胞凋亡摘要：细胞凋亡是细胞的一种主动发出的基本生物学现象，在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。Caspase半胱氨酸蛋白酶家族作为细胞凋亡过程中的中心环节和执行者，近年来受到了广泛的关注。现就caspase家族的生化特性、激活途径、底物和抑制剂以及与一些凋亡相关疾病的联系进行综述。关键词：caspase；细胞凋亡；激活；抑制剂；疾病迄今为止，凋亡过程确切机制尚不完全清楚，但凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系。细胞凋亡涉及一系列蛋白，如caspase家族蛋白、Bcl一2家族蛋白和p53蛋白、survivin。其中caspase半

2、胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)家族，也称为ICECED一3家族，是美丽线虫(Caenorhabditis elegans)死亡基因CED一3的同源物。这类蛋白酶与细胞凋亡形态学特征变化(如细胞膜空泡形成、核膜破裂、染色质聚集和边聚及DNA断裂等)以及一些生化改变关系密切。1 caspase的生化特性从1992年人类第一次纯化Caspase-1克隆并测序其cDNA至今,Caspase 家族中共有14 个成员被克隆出，它们在氨基酸序列、结构及酶的特性上均相似，正常时均以无活性的酶原形式存在。酶原分子由一个

3、N端前域及一大一小两个亚基组成。酶原分子激活后,大小亚基解离并重新组装为四聚体形式的活性酶两个小亚基单位在中间，两个大亚基单位在外周每个异二聚体包含一个催化位点。大小亚基的同源性较高而N端前域的同源性较低，因此N端前域成为区别Caspase家族各成员的重要指标。Caspase分为三大类：凋亡启动因子(apoptotic initiators)、凋亡执行因子(apoptotic executioners)和炎症介导因子(inflammatory mediators)，构成了级联放大效应。凋亡启动因子在级联反应的上游，包括Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-

4、10等,能在其它蛋白辅助下发生自我活化并识别和激活下游的Caspase。如Caspase-8几乎能激活所有凋亡级联反应下游的Caspase而诱发凋亡1-2 。凋亡执行因子在级联反应的下游，包括Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7等，作用于其特异性底物并导致细胞凋亡。如Caspase-3，是Caspase家族中的最重要的凋亡执行者之一，是细胞凋亡过程中的主要效应因子。它的活化是凋亡进入不可逆阶段标志3 。炎症介导因子包括Caspase-l、Caspase-4、Caspase-5和Caspase-1l,介导炎症反应并在死亡受体介导的细胞凋亡途径中起辅助作用。2 Caspase

5、的激活机制根据起始激活的Caspase不同，凋亡激活的途径分为3种。外源性途径始于细胞表面死亡受体。因此也称作死亡受体途径。细胞死亡受体属于肿瘤坏死因子TNF、神经生长因子NGF超家族，如Fas、TNFR1(TNF receptor-1) 。由于各种细胞凋亡信号的刺激，FasL(Fas ligand)和TNF 作用于相应的受体，使得内源性Fas相关死亡结构域(Fas associated death domain，FADD)和Fas发生直接的作用，生成FasL-Fas-FADD凋亡复合物而使细胞凋亡。而TNFR相关死亡结构域(TNFR associated death domain，TRADD

6、)通过与死亡域间的相互作用，与TNFR1直接结合。间接使TNFR1和FADD相结合形成TNF-TNFR1-TRADD-FADD复合物。复合物形成后FADD的死亡效应区即和Caspase-8酶原或Caspase-10酶原结合。使Caspase酶原活化为有活性的Caspase。活化的Caspase-8或10激活下游的Caspase-3、6、7，最终导致细胞的凋亡。内源性细胞凋亡途径始于线粒体，因此也称为线粒体途径。当受到细胞凋亡信号刺激。线粒体释放细胞色素C至细胞浆中。细胞色素C与细胞内存在的一种凋亡细胞蛋白酶激活因子(Apoptosis Protease Activating Factor-1，

7、Apaf-1)结合，在dATP存在的条件下，通过半胱氨酸蛋白酶募集域的作用，Apaf1和Caspase-9酶原结合。使Caspase-9酶原活化，然后激活下游的效应半胱氨酸蛋白酶如Caspase-2、3、6、7、8、10，从而启动细胞凋亡。内质网相关细胞凋亡是一种新的细胞凋亡途径。内质网与细胞凋亡相联系表现在两个方面4；一是内质网对Ca2+的调控，二是内质网应激反应。内质网是细胞内最重要的蛋白质合成折叠的场所，它包含有钙调节分子伴侣，腔内还包含有凋亡蛋白（如caspase-12,Bap31 和Bcl-2）5。钙调节分子伴侣凋亡蛋白决定了细胞对内质网应激和凋亡的敏感性。很多细胞在凋亡早期会出现胞

8、质内Ca2+浓度迅速持续的升高，一方面可以激活胞质中的钙依赖性蛋白酶（如calpain）,另一方面可以作用于线粒体，影响其通透性的改变，进而促进凋亡。内质网内错误折叠蛋白质聚集就会导致内质网分子伴侣基因表达激活，触发内质网未折叠反应（UPR）。当未折叠蛋白质过度聚集变成有毒性时就会触发细胞凋亡。信号主要通过caspase-12下传。钙离子依赖性蛋白激酶可以直接剪切并激活Caspase-12。另外，内质网应激也可以导致胞质Caspase-7和Bim向内质网表面移位，激活Caspase-12和级联反应的发生6。最近有研究表明caspase-4也参与内质网应激所引起的细胞凋亡反应7。3 底物和抑制物

9、Caspase的底物种类繁多,下游Caspase激活后,作用于相应底物,引起细胞凋亡。根据底物特性的不同,Caspase 底物主要分为4类8。第1 类为细胞骨架和结构蛋白,包括Lamins , Gas2 ,Actin , Fodrin ,- Catenin ,Gelsolin等,Lamin-B被Caspase-6降解后可导致核塌陷。Gelsolin被切割后可使细胞发生膜皱缩、凋亡小体形成等形态学改变。- Catenin ,Plakoglobin是细胞及组织间的粘附蛋白,其被Caspase降解后,使细胞脱离原有组织以利于吞噬细胞将其清除。第2类为调节细胞周期及DNA复制的蛋白,包括Cyclin-

10、A, NuMA ,MCM3 ,RB 等,MCM3是核复制因子,Cyclin A,NuMA是有丝分裂装置蛋白,Caspase 切割上述底物后,能抑制DNA复制,干扰细胞的有丝分裂。Rb为视网膜母细胞瘤基因,是人类最早发现一种抑癌基因,其表达产物RB 蛋白对细胞周期有抑制作用, 降解后其对细胞周期的负相调控作用被解除。第3类为DNA 修复及切割酶类,包括PARP(poly ADP-ribose polymerase) ,DNA-PK(DNA-dependent protein kinase), ICAD/ CAD(caspase-activated DNase)等。PARP ,DNA-PK均为DN

11、A修复酶,二者被切割后丧失了对DNA的修复功能。CAD是Caspase激活的脱氧核糖核酸酶,在人类又称为DNA片段化因子(DNA fragmentation factor ,DFF),通常情况下CAD与其抑制剂ICAD结合成无活性的复合物存在于胞浆中,Caspase能灭活ICAD,解除ICAD对CAD的抑制作用,解离后的CAD从胞浆进入核内,降解DNA。第4类为激酶类,包括PRK2、MEKK-1、PKC、PAK2、CDK4等,这类酶均与细胞内的信号传输有关,Caspase作用于上述酶,使酶丧失活性而阻碍信号传递,影响细胞功能。caspase酶原包括原域、大亚单位和小亚单位。一旦原域以及大、小亚

12、单位之间的连结被切除，大小亚单位之间相互作用形成一个异二聚体，其中包含一个活性位点；两个异二聚体形成一个四聚体，成为Caspase的活化形式。因此，近年来caspase抑制剂的设计、合成主要是基于Caspase底物切割位点的特异性，连接一些化学基团从而达到抑制的效果，许多肽类抑制剂具有上述特点9-10。与此同时，非肽类caspase抑制剂的合成研究也得到了迅猛发展。这一类抑制剂的特点是分子小，膜通透性好，对Caspase抑制活性及选择性好11-12。肽类和非肽类抑制剂又分别有天然和非天然两种。Caspase抑制剂的设计，主要包括3个策略，即通过与Caspase活性中心的半胱氨酸残基结合实现的半

13、胱氨酸蛋白酶抑制剂(如碘乙酰胺)、基于Caspase底物切割位点的特异性而研制的特异性抑制剂(如三聚体z-VAD-FMK)以及小分子化合物1(如异硫脲类化合物、3-亚硝基苯甲酰胺等)。从抑制剂化学结构上看，合成肽类是目前研究的重点。13 凋亡抑制剂IAPs(inhibitor of apoptosls)则与上述的抑制剂不同，是哺乳动物细胞凋亡的内源性抑制剂，可以直接抑制caspase或caspase酶原活化以及通过调节转求因子NFKB等抑制细胞凋亡，其成员之一XiAP能通过直接抑制Caspase-3和Caspase-7来发挥作用。新近发现的Survivin也是IAPs成员之一，它存在于大多数转

14、化细胞系和癌细胞中，能直接抑制Caspase和细胞凋亡。144 caspase与凋亡相关疾病的联系4.1与肿瘤的联系肿瘤是一种细胞增殖和分化异常的疾病，同时也是细胞凋亡异常的疾病。大量资料显示，在许多肿瘤细胞的凋亡中发现有Caspase的活化。目前也已经发现一系列新的与caspase有关的诱导凋亡的方法来治疗来治疗肿瘤，对大部分肿瘤有实际意义，并可望在恶性肿瘤的治疗方面取得新的突破。Shinoura等用腺病毒载体将Caspase-3基因导人乳腺癌细胞系MCF-7和胶质神经瘤细胞系U251和U373中，发现单独使用Caspase-3基因时无明显的细胞凋亡变化，联合使用Fas配体(FL)基因或Fa

15、s抗体时，细胞的凋亡比两者单独使用时有显著的增加。15新近的研究表明，在获得性药物抗性(acquireddrug resistance，ADR)的MCF-7细胞系中，用腺病毒载体导人Caspase-3基因。此时ADR细胞比转入前的细胞中的Caspase-3蛋白水平和Caspase-3酶活性分别增加2.8倍和3.7倍，同时发现前体Caspase一3的高表达，对细胞无毒性作用并对细胞凋亡水平没有影响，但这时它别药物的敏感性却达到没有ADR存在的细胞的水平，提示Caspase在化疗药物的抗药性中具有重要的作用和应用潜能。164.2与缺血-再灌注的联系多数学者认为，凋亡是心肌缺血及再灌注细胞死亡的一种

16、主要形式。研究表明，应用了caspase-3选择性抑制剂Z-DEVD-fmk之后，缺血再灌注大鼠心肌3h TUNEL检测结果显示，caspase-3抑制剂组心肌TUNEL阳性细胞明显减少17。而Caspase-3表达过度的小鼠，即使表型正常，其脑局部缺血再灌注模型也会表现为创伤较大，凋亡细胞增加。18另外，在脑、肺、四肢的缺血再灌注试验中，caspase也被证明参与了凋亡过程。4.3与组织损伤的联系在组织损伤和炎症过程中，中性粒细胞和其它的滞留细胞均通过凋亡机制，在细胞膜整的情况下被巨噬细胞识别和清除，从而避免继发的炎症反应。在执行细胞凋亡和促进创伤愈合的过程中Caspase发挥重要的作用。目

17、前已证明Caspase与中枢神经损伤、皮肤损伤及其它内脏损伤和炎症反应有关。如Akasaka对瘢痕疙瘩的成纤维细胞研究显示，caspase-3能减少细胞生存、促进细胞凋亡，最近又发现Caspase-9的激活,细胞色素C的释放可能是体内瘢痕疙瘩的成纤维细胞凋亡的基础。19-204.4与PTSD的联系创伤后应激障碍（posttraumatic stress disorder，PTSD）是指由于异常威胁性或灾难性心理创伤导致延迟出现和长期持续的精神障碍，是应激疾病中最为典型的一种。线粒体细胞色素C可通过对凋亡信号的转导和放大作用调控细胞凋亡，当细胞色素C释放到胞浆后，可通过激活Caspase-3来介

18、导细胞凋亡21。已有研究报道，创伤后应激障碍大鼠杏仁核神经元细胞发生凋亡22。实验通过对PTSD大鼠杏仁核COX的检测发现，SPS刺激后7d内，大鼠杏仁核神经元COX活性持续减弱，COXII mRNA的表达于SPS 1d时开始减少，并逐渐减少，至SPS 7d是表达最低，而Caspase-3 mRNA的表达则呈现相反的趋势，呈现逐渐上调的趋势，于SPS 1d时表达出现增加，至SPS 7d时表达最高。由此可见，SPS刺激引起大鼠杏仁核神经元线粒体中的COX的释放，从而导致呼吸酶活性发生改变，线粒体功能受损，其释放也激活凋亡蛋白酶Caspase-3，导致杏仁核神经元细胞凋亡，最终影响杏仁核的功能23

19、。5 结语和展望作为凋亡机制中重要的效应成分,Caspase家族参与多种与凋亡有关的生理和病理过程。在诸如生长因子撤除、热休克、细胞因子和DNA损伤剂等刺激作用下,细胞内多种凋亡信号传导途径被活化,最终将会聚于Caspase家族蛋白酶这一共同的遗传保守机制。因此随着对Caspase的结构、特性及其在凋亡中的作用不断深入的了解,将有助于人类对生命奥秘的了解和各种疾病的诊断和最终治疗。参考文献：1Scatena R，Bottoni P，Botta G，et a1The role of mitochondria in pharmacotoxicology：a reevaluation of an o

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