RT-PCR操作流程及其相关注意事项(优选.)

1、RT-PCR知识背景:1、基因表达： DNA r RNA p Protein2、PCR 技术(Polymerase chain reaction )：即聚合酶链式反应。在模板、引物和四种脱氧核甘酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA;B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2+存在下，退火引物沿 5-3'方向延伸。以上三步为一个循环，如此反复。3、逆转录酶和 RT-PCR逆转录酶(reverse transcript

2、ase)是存在于 RNA病毒体内的依赖 RNA的DNA聚合酶， 至少具有以下三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以 RNA为模板合成cDNA第一条链；2、RNase水解活性：水解 RNA:DNA杂合体中的RNA ;3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条 DNA链为模板合成互补的双链 cDNA.4、引物的设计及其原则：引物的特异性决定 PCR反应特异性。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。a、引物长度：一般为1530bp ,引物太短会影响 PCR的特异性，引物太长 PCR的最适延 伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的

3、特异性。b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免喋吟或喀咤的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。 GC含量(Tm值)：40%60%, PCR扩增的复性温度一般是较低 Tm 值减去510度。c、 3端要求：3'端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是A时错配的引发效率最低，G、C居中间，因此引物的3'端最好选用A、G、C而尽可能避免连续出现两个以上的Tod、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。e、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于 4个连续碱基互补，3'端不应超过2

4、个。f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8个的互补碱基存在。g、5'端无严格限制：5'末端碱基可以游离， 但最好是G或C,使PCR产物的末端结合稳定。 还可以进行特异修饰(标记、酶切位点等)等等。根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如 Primer5.0, Oligo6.0等对于这些条件都可以自行设置。RNA提取（用Trizol法提取）RNA提取的一般步骤是：破碎组织 一分离RNA沉淀RNA洗涤RNA融解RNA 保存 RNA注意事项：1、整个操作过程中总是带着帽子、口罩和手套2、整个RT-PCR过程均必须 使用无菌无 RNA酶的制品（玻璃物品和饭盒 需在

5、180c烤箱烘烤10h,注意烘烤时最好是早上开 180 c烤箱，晚上到时间后一定要关掉，第二天早上RNA将所需物品取出。取东西时需带好帽子和口罩，轻柔操作，防止有空气逆流入烤箱引起 酶污染；塑料制品泡1%°DEPCK 72h,DEPC水提前一天配制，并用玻璃棒搅拌混匀。连续高温高压消毒3次，以充分降解 DEPC）3、除非特别注明，所有程序均在室温（1530C）下进行，试剂也放置于室温。4、提RNA前，收拾干净试验台，尽量不要放无关的物品；将 试验台桌面用普通的75刷精 仔细擦两遍；将所需用到的移液器全部用普通的75刷精仔细擦拭干净。需要的试剂：氯仿、异丙醇（装此试剂的广口瓶，瓶盖最好

6、用锡箔纸包一下）75叱醇（溶于DEPCM理的水中）DEPC-treated water : 100ul DEPC +100 ml ddH2O 制成 1%°DEPCK,放入 RNase-free 的玻璃瓶中用RNase-free的玻璃棒搅拌，静置 12小时以上，高温高压消毒。RNase-free H2O的制备：把水加入到 RNase-free的玻璃瓶中，加入 DEPCS 0.01% （v/v ）, 静置过夜，高压蒸汽灭菌，连续 3遍。需要的器具:100ml棕色广口瓶2个、100ml白色广口瓶4个、车t子2把、饭盒一个、100ml量筒一个、 蓝、黄、白Tip头若干、1.5EP管、0.5E

7、P管、PCR管若干、PE手套、锡箔纸若干、4c离 心机需提前降温、1200ul、1000ul、400ul平衡管，大培养皿一套，滤纸、滴管 3支，比色 皿1个操作步骤：1、均质化：单层培养的细胞，直接在培养瓶中裂解。倒掉培基，中号培养瓶中直接加入1mlTrizol试剂（含有苯酚、异硫鼠酸月瓜等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶），加入后即反复抽吸、吹打细胞数次（约 2040次）室温（1530C）孵育5min （以利于匀浆样品中核蛋白体完全解离）转移均质溶?到新的 1.5mlEP管中2、相分离:每ImlTrizol试剂加入200ul氯仿，小心盖紧管盖（单手操作；将装氯仿和异丙醇的广口瓶放

8、在正前方远离自己的位置，操作时不会越过瓶口上方造成污染；取氯仿时，不要把瓶盖放在桌面上，取完立即盖好瓶盖）用手剧烈震荡15s室温（1530C）静置23min （215min）4c 12000g离心15min（将EP管在离心机取出时需十分小心，尽量不要使 EP管晃动）RNA存在于水相中，水相体积约为60%均质化时使用的Trizol试剂量水相（无色）中间相，白色红色下层（酚、氯仿相）word.3、RNA沉淀水相转移至一个新的 1.5mlEP管【注意：EP管垂直；枪垂直、贴壁、用200ul枪缓慢抽；一共最多抽400ul,宁缺勿滥】混合冷的异丙醇（或冷的乙醇：因 DNA、RNA都溶于水而不溶于乙醇或异

9、丙醇，因此，常 用乙醇来沉淀溶液中的DNA和RNA。DNA溶于苯酚而 RNA不溶，故可用苯酚来沉淀RNA。乙醇能够消除 RNA的水化层，从而使 RNA从水中沉淀下来），以从水相中沉淀RNA ,每1ml用于初始同质化的 Trizol试剂，使用500ul异丙醇，轻轻颠倒混匀12次室温（1530C）孵育样品10min（510min）【将逆转录的试剂置于冰上溶解备用】4C 12000g离心10min（往往离心前 RNAM淀不可见，离心后在管侧面和底部形成一个凝胶 样沉淀）4、RNA洗涤弃上清（缓慢倒出）用75%乙醇（25%的水去无机盐） 洗涤RNA沉淀一次1ml乙醇）每ml用于初始同质化的 Trizo

10、l试剂使用至少1ml75%乙醇（可用75%乙醇预洗一次一一放 进去乙醇，不漩涡，小心倒掉；再加入漩涡混合4 c 7500g 离心 5minJ缓慢倒出上清液，再用小离心机离心数秒，用20ul的枪移走剩余的水， 以保证整个EP管的干燥是同步的。整个过程一定要小心。5、重新溶解RNA简单干燥RNA沉淀（让乙醇充分挥发）一一空气干燥510min【将有RNA沉淀的EP管放入 装有滤纸的大培养皿中；不要让RNA沉淀完全干燥，这将大大降低其溶解度】用无RNAse free water （经DEPC处理的水）（逆转录试剂盒里的一般用不完）20ul吹打几次,溶解RNA用紫外分光光度计 测定A260/A280及R

11、NA的浓度1.82.0比较好（或电泳）注：1、紫外分光光度计的使用：打开后面的电源一按 RNA一确定RNA对应的设置时1OD=40 一向比色皿中加入 50ul高温 消毒之后的三蒸水一 blank一将其中的水吸出一加入3ulRNA+47ul三蒸水漩涡混匀后的样品一dilution enterf sample （默认光程为 10mm,比色皿光面对着自己）2、融解RNA 一般使用TE Buffer ，保存RNA应该尽量低温（TE缓冲液是弱碱性，对DNA 的碱基有保护性，（DNA在它是的稳定性较好，不易破坏其完整性或产生开环及断裂 ，包括提 取好的DNA也要放在TE缓冲液保存.）逆转录 （应用 Gen

12、eCopoeia TM First Strand cDNA Synthesis Kit ）：1、准备：缓慢颠倒混匀试剂，避免起泡，并经 瞬时离心后，放置冰上待用。用于制备 RNA-Primer Mix 的EP管需在冰上预冷。2、制备RNA-Primer Mix （RNA-弓I物混合）,轻弹几下混匀，瞬时离心终含量total RNA2ug60 科 M Oligo(dT)182.4ddH2O (DNase/RNase Free)To 13ul3、变性RNA65c加热RNA-Primer Mix , 10min （RNA二级结构打开，增加反应产量）立即放置冰上冷却 （消除RNA大多数二级结构，从而使

13、引物可以结合）4、配制逆转录反应液：在已冷却的RNA-Primer Mix反应管内加入以下试剂至总体积25试剂组分体积终浓度RNA-Primer Mix135 >RT Reaction Buffer5 口1 X25 mM dNTP1科11 mM25 U/ pl RNase Inhibitor1 口1 U/ul200U/ul M-MLV RTase (RNase H-)1 口8U/ulddH2O (DNase/RNase Free)4科1总体积25ul5、逆转录反应混匀反应 Mix,瞬时离心，42 C 60min6、灭活并保存逆转录产物加热至85 C 5min,终止反应一在 PCR仪上设置

14、4 C hold将cDNA 保存于-20 CRT-PCR勺步骤在冰浴离心管里面加入模板 RNA 4uL引物2uL,去离子水5uL,混匀，离心 3-5 秒；70度水浴5分钟，冰浴30秒（此处是为了使引物和模板正确配对）；加入5X反应液4uL, RNase®制剂1uL, dNTP2uL （这些应该先配好，然后分 再装到每一管），混匀；37度水浴5分钟，加入1uL AMV-RT5转录酶，混匀；37度水浴1小时（此步是反转录过程）；（6）70度10分钟结束反应（此处是灭活酶活性，避免对后续实验产生干扰），产物置冰上进行下一步PCRS；验，余下的-70度保存。PCR阶段:反应体系50 dL=P

15、CR-Mix+模板+弓【物1+引物2+去RNA酶的水反应条件：95c预变性5min后，94c变性30s, 55c退火40s, 72c延 伸1min；共进行35个循环后72 c延伸10min。取10pL产物1.0%琼脂糖凝胶 电泳、照相。并采用凝胶图像处理软件 ImageTool （IT） 3.0测量灰度值，计算 mRNA表达的相对值。计算方法：mRNA表达的相对值=目的基因灰度值/ 3-actin灰度值。凝胶电泳：1、先高火煮琼脂糖，见快要冒泡时即转到低火，直至溶液清亮为止。开始可能 会冒泡比较多，不要让其溢出来，之后就不会冒出来了。2、灌胶时，先缓慢灌胶再插梳齿，不容易出气泡。3、电泳缓冲液

16、最好每次都用新的；至少要保证电泳缓冲液中不能有很多气泡。3、胶跑到中间时，可以放到机子上去显影，看有无目的条带，是否需要继续跑。trizol试剂盒提取总RNA。取2仙g总RNA进行逆转录后各取7.5仙L行PCR反 应，B -actin为内参照。TRX 引物：上游为 5'-CATATGGTGAAGCAGATCGAGAG- 3',下游为5'- TGTCACGCAG A T G GCAACTG - 3',扩增片段大小为 420bp。B -actin 引物：上游为 5'-CCTTCCTG GGCATGGAGTCCT-3',下游为5'- GGAGCAATGATCTT GATCT T-3',扩增片段大小为 204bpo4、分离不同大小 DNA片段的合适琼脂糖浓度琼脂糖浓度（%）线TDNA片段的有效分离范围（kb）0.51 300.70.8121.00.5-101.20.471.50.235、电泳缓冲液配方:TAE (Tris-乙酸) 工作液 (1X) 40mmol/L Tris-乙酸 Immol/ L EDTATBE (Tris-硼酸)0.5 X545 mmol/L Tris-硼酸 1mmol/ L EDT