重组人Leptin的表达、纯化及免疫学与生物学活性鉴定

1、重组人Leptin的表达、纯化及免疫学与生物学活性鉴定张 砡，王晓辉，冯泽国（解放军总医院麻醉手术中心 北京 100853）【摘要】目的：为了获得重组人Leptin（rh-leptin）蛋白高表达的菌株及大量具有生物活性的rh-leptin蛋白，构建Leptin重组表达载体，转化感受态细菌进行表达，对rh-leptin蛋白进行复性及纯化，并鉴定其免疫学及生物学活性。方法：提取脂肪组织RNA，通过RT-PCR方法获得用PCR方法扩增人Leptin的编码区，使产物与pGEM-T easy载体相连，转染DH5。测序后,选出阳性克隆质粒扩增。将酶切后的leptin片段与pET-28a(+)载体连接，获

2、得leptin的表达质粒。将重组表达质粒转入BL21(DE3)，测序结果显示Leptin编码区没有突变产生，用IPTG诱导leptin重组蛋白表达。表达产物进行SDS-PAGE电泳及Western印迹杂交进行免疫学分析。并通过Km小鼠减肥实验及胃肠推进率测定实验检验其生物学活性。结果：在包涵体蛋白22 kDa处有明显的新增蛋白带,其含量超过总蛋白的50；经Western-blot证实为重组的人leptin蛋白。大量表达后，经蛋白复性和纯化，通过Km小鼠减肥实验及胃肠推进率测定实验证实重组表达的人Leptin蛋白具有生物学活性。结论：成功构建了rhleptin的高表达菌株，建立了rhleptin

3、的纯化与复性方法，经验证表达产物具有免疫学及生物学活性，可供进一步基础及临床研究应用。 【关键词】rhleptin；克隆; 表达; 融合蛋白; 大肠杆菌；复性；蛋白纯化；生物活性Expression, Purification and Identification for Immunological and Biological Activity of Recombined Human LeptinAbstractObjective: To obtain effective method of high recombined human leptin (rh-leptin) expressio

4、n in E. coli and the method of purifying and renaturing the rh-leption protein, then to obtain a large amount of rh-leptin protein with immunological and biological activity for further research. Methods: The adipose Leptin CDs was obtained by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)

5、 and cloned by PCR, and the product was connected with pGEM-T easy and transformed into DH5. After DNA sequencing, the positive colonies were picked out and amplified. The cleaved leptin fragment was cloned into pET-28a(+).Then, the recombined plasmid of leptin was transformed into BL21(DE3). DNA se

6、quencing result showed that no mutation was found in rh-leptins CDS. After IPTG induction, the cell lysate was directly used for SDS-PAGE. After purification and renaturation, the immunological activity of rh-leptin was checked by Western-blot. Its biological activity was checked by reducing the wei

7、ght and food intake and inhibiting the gastrointestinal motility of Km mice. Results: There was a new band of protein ( 50 % total protein) around 22 KDa on SDS-PAGE. The band was proved by Western-blot to be rh-leptin, which was highly expressed in the BL21(DE3)/ pET-28a(+) system , and the rh-lept

8、in has immunological activity. Its biological activity was confirmed by reducing the weight and food intake and inhibiting the gastrointestinal motility of Km mice. Conclusion: Highly expressed rh-leptin can be obtained in our lab. Purified rh-leptin with immunological and biological activity may be

9、 used in further research.Key words：Cloning; Expression; Fusion Protein; E. coli; Rh-leptin; Renaturation; Protein purification; Biological activityLeptin（瘦素或消脂素）是ob基因编码的活性蛋白分子，主要由脂肪细胞产生，在调节机体摄食和能量代谢中发挥着主要作用。近年来，临床实验表明，血清leptin水平异常与多种疾病的发生发展密切相关1。为了进一步探讨Leptin的生物学作用，大量获得Leptin蛋白以便进一步研究其功能及调节机制，探讨rh-

10、leptin(重组人Leptin)用于临床治疗的可行性和生理作用，我们对人Leptin进行了克隆重组及表达，对rh-leptin进行复性和纯化后，鉴定其免疫学和生物学活性。材料与方法1 材料1.1 质粒和菌株 pGEM-T easy克隆载体为Promega公司产品；pET-28a表达载体为Novagen公司产品；DH5和BL21（DE3）宿主菌株为TIANGEN公司产品。1.2 组织来源 取自手术患者腹部皮下脂肪。1.3 酶和试剂 各种酶类，如AMV逆转录酶、Taq酶、限制性内切酶EcoR、Xhol和T4连接酶，以及质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、异丙基硫代-D-半乳糖苷（IPTG）等为

11、Promega公司产品；Trizol为Invitorgen公司产品；兔抗人Leptin多克隆抗体(PcAb)为本室免疫获得，抗His.Tag单克隆抗体(McAb)及羊抗兔IgG(二抗)为普利莱公司产品。1.4 引物合成 根据GenBank数据，针对Leptin的编码区进行引物设计。在上、下游引物的5端分别加入酶切位点EcoR和Xho。上游引物（U）序列：5 CG GAA TTC ATG CAT TGG GGA ACC CTG TG 3；下游引物（D）序列：5 CCG CTCGAG TCA GCA CCC AGG GCT GAG GT 3（北京奥科公司合成）。1.5 缓冲液配置 缓冲液A为Tri

12、s-HCl 50mmol/L，PH7.9，含EDTA 0.5mmol/L，NaCl 50mmol/L，DTT 0.25mmol/L，甘油5%；缓冲液B为Tris-HCl 50mmol/L，PH7.9，含EDTA 0.5mmol/L，NaCl 50mmol/L，DTT 0.25mmol/L，甘油15%。1.6 实验动物 20g左右的雄性Km小鼠32只，由解放军总医院实验动物中心提供。2 方法2.1 RT-PCR扩增 将脂肪组织(350 mg)置于冰浴后的Trizol(1.2ml)中匀浆，提取总RNA，测量处吸光度值(A260),定量后立即逆转录再进行PCR扩增，反应条件为：94，30s；66，5

13、0s；70，60s。共32个循环。2.2 Leptin克隆载体的构建 将上述带有酶切位点的leptin PCR扩增产物进行DNA凝胶纯化回收后，在T4连接酶作用下，与pGEM-T easy载体相连，构建leptin的克隆载体，转染DH5感受态细胞，提取质粒进行测序鉴定（北京华大公司）。2.3 Leptin原核表达载体的构建及转化 利用EcoR和Xho分别酶切构建好的leptin克隆载体以及pET-28a(+)表达载体，将获得的二者产物经凝胶纯化回收后,进行连接，构建leptin表达载体。将连接产物转染DH5，提取质粒进行测序鉴定，阳性质粒转化E .coli BL21(DE3)菌株。2.4诱导H

14、is.Tag-Leptin融合蛋白表达 挑转化后单菌落，在LB培养液中37 振荡过夜。培养物1：100稀释，继续培养至对数生长中期（A550=0.8），加入IPTG（1 mmol/L）于22 诱导4 h。超声破碎细菌后，分别取上清及包涵体进行表达分析。2.5 表达蛋白的分析鉴定 将上清及包涵体样品分别于12 %聚丙烯酰胺凝胶上进行垂直电泳（SDS-PAGE），鉴定leptin融合蛋白表达的位置。2.6包涵体的制备 取200mL 含有rh-leptin表达质粒的E.coli菌液，经组织破碎器短暂匀浆后重悬于20mL缓冲液A中，在冰浴中超声裂菌，4、13000r/min离心10min，收集沉淀的包

15、涵体，用0.1%Triton-100洗涤2次。以19.6mL缓冲液A和0.4 mL 20%SKL悬浮包涵体，室温静置30min，4、13000r/min离心10min，收集上清。2.7 rh-Leptin复性与浓缩 对溶解物进行蛋白定量。用缓冲液B稀释溶解蛋白至0.1mg/mL，SKL终浓度为0.04%。4溶解蛋白，以1000mL缓冲液A搅拌透析24h，间隔换液3次。取出后浓缩至20-30mL。2.8 rh-leptin的免疫活性鉴定 将蛋白样品于12 %SDS-PAGE电泳，电转移至硝酸纤维素膜。封闭后,与leptin PcAb结合，进行Western印迹杂交检测，利用ECL系统进行显色。2

16、.9 rh-leptin的生物活性鉴定 Km小鼠正常饲养3天，去除体重17g和21g的小鼠，随机分为两组（n10）。禁食48h，降低内源性leptin水平后，按rh-leptin 2.5mg/kg或缓冲液7.75mL/kg，腹腔注射2/日，每日定时称重并观察食物摄入量。12只Km小鼠随机分为rh-leptin组（n=6）和对照组（n=6）。禁食12h，腹腔注射rh-leptin 2.5mg/kg或生理盐水12.5mL/kg，3h后每只小鼠均给予5%炭末阿拉伯胶混悬液0.2mL/10g。灌胃后15min，小鼠颈椎脱臼法处死，剖开小鼠腹腔，取出胃肠道(去除肠系膜)，将肠管下端坠以5g砝码。以幽门为

17、起点，测量炭末在肠管内的移动距离和小肠（自幽门至回盲部）的全长，计算每只小鼠炭末移动距离占小肠全长的百分率，比较两组小鼠结果的差异。2.10 统计学方法 实验数据以表示，采用SPSS 11.0软件进行成组t检验，P0.05为差异有统计学意义。实验结果：1、PCR扩增人leptin编码区序列：PCR扩增人leptin编码区序列产物如图1所示，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，于520 bp处出现清晰的条带，与预计的leptin大小（521 bp）相符。图1 Leptin编码区PCR扩增产物电泳注：1.为DL 2000 DNA 分子量标准(DNA marker);2.为带酶切位点的leptin编

18、码区PCR扩增产物 2、pET-28a(+)-leptin重组质粒的测序鉴定：将构建好的表达质粒进行测序，测序结果与Genbank数据库中人leptin的CDS序列完全一致，表明目的基因完全符合设计要求。3、pET-28a(+)-lepin重组质粒表达产物的分析：如图2所示，经SDS-PAGE电泳分析，重组表达产物在22 kDa处有一明显的条带（与leptin相符），且主要存在于包涵体中(占总蛋白的50以上)，而对照组则无相应产物出现。图2 pET-28a(+)-lepin重组质粒表达产物SDS-PAGE分析注：14为对照组，分别为： pET-28a(+)空质粒IPTG诱导4 h 后:1.包涵

19、体；2.上清； pET-28a(+)空质粒无诱导4 h后: 3.包涵体；4.上清。5、6为重组质粒表达产物： pET-28a(+)-lepin重组质粒IPTG诱导4 h后: 5.包涵体；6.上清。4、rh-leptin的免疫学活性鉴定：分别利用leptin PcAb及His.Tag McAb的抗体进行Western印迹杂交，证实了此条带的特异性（图3 A、图3 B）。且融合蛋白His.Tag-leptin在菌体上清及包涵体中均有表达，但主要在包涵体中存在。图3 Western印迹杂交分析重组表达蛋白的特异性注：图3 A为用leptin PcAb进行Western blot分析的结果；图3 B为

20、用His.Tag McAb进行Western blot分析结果。 图中14均为对照组，即pET-28a(+)空质粒IPTG诱导4 h后：1.包涵体；2.上清； pET-28a(+)空质粒无诱导4 h后: 3.包涵体；4.上清。5、6为重组质粒表达产物： pET-28a(+)-lepin重组质粒IPTG诱导4 h后: 5.包涵体；6.上清。5、rh-leptin的生物活性鉴定：由图4可见，小鼠腹腔注射rh-leptin 2天后体重增长即明显低于缓冲液组，且整个实验期内rh-leptin组小鼠的体重改变比（体重改变量/原始体重100）均小于缓冲液组。图4 rh-leptin对小鼠体重改变比(%)的

21、影响（n=10）注：与缓冲液组相比，*P0.05 rhleptin组； 缓冲液组腹腔注射rh-leptin对进食的抑制情况见图5，整个实验期内rh-leptin组小鼠的进食量改变比明显低于缓冲液组，显著抑制小鼠进食。由此可见重组表达的leptin具有良好的生物学活性。图5 rh-leptin对小鼠进食量改变比(%)的影响（n=10）注：与缓冲液组相比，*P0.05 rhleptin组； 缓冲液组rh-leptin组小鼠胃肠推进率明显低于生理盐水组（P0.05），说明腹腔注射rh-leptin在一定时间范围内可以抑制小鼠胃肠推进运动。同样证明了rh-leptin具有生物学活性。表 rhlepti

22、n组与生理盐水组胃肠炭末推进率比较组别动物数（只）胃肠推进率(%)rh-leptin组生理盐水组6641.985.81 *54.5311.08注：与生理盐水组相比，*P 0.05。讨 论自从1994年Zhang等首次从脂肪细胞里克隆出ob基因以来，leptin迅速成为人们关注的焦点2。研究表明：leptin作为一种脂肪组织与下丘脑之间的信号传导蛋白对维持体内正常的脂肪水平起着重要的作用。因此，最初的针对leptin的研究主要局限在减肥领域。但是，在进行II期临床研究时发现，leptin在人体中减肥效果非常微弱，远低于在动物试验中取得的效果。 越来越多的研究证实，作为一种脂肪细胞因子，Lepti

23、n参与了糖尿病、神经内分泌性高血压、肝炎和肝纤维化、创伤感染等引起的脓毒血症、部分重要脏器的缺血再灌注损伤过程等病理生理的调节机制3，4, 具有广泛的生物学效应。目前已观察到多种药物（格列酮类、他汀类、贝特类、血清转胺酶抑制剂、大麻素-1 受体拮抗剂）可以影响血清中leptin水平5。表明leptin 在病理状态时具有潜在的作用。我们近期的研究发现：肝脏I/R损伤、严重肺感染致多器官衰竭综合征患者及急性心梗患者的血清leptin水平与正常人相比显著升高，提示它可能是急性炎症发生后的重要应答因子6，7。研究者们认为leptin是一个颇具前景的具有多元化作用的治疗靶点。因此，重组表达和纯化有生物活

24、性的rh-leptin对于继续研究leptin在创伤修复及应激反应中的保护作用具有重要意义。Novagen公司的pET表达体系是目前在原核细胞中克隆和表达融合蛋白的最佳体系之一。本实验选用BL21(DE3)/pET-28a()作为表达体系有下述优点： pET-28a()使用T7Lac启动子，其上游的LacI编码足够的Lac抑制子，阻断T7RNA聚合酶的产生和其对外源基因的转录，使基础表达水平降到最低，可提高重组质粒的稳定性。 pET-28a()的多克隆位点区域(BamH-Xho)下游含有多个转录终止信号，可以有效地阻止通读；转录的mRNA3-尾形成二级环状结构，可阻止降解，延长寿命8。 BL2

25、1（DE3）菌株缺乏OmpT外膜蛋白酶，有利于防止表达产物在提纯时降解;携带T7 RNA聚合酶基因的噬菌体DE3已整合于细菌基因组，可通过IPTG诱导使之表达，进而启动T7 Lac启动子，开始目的基因转录和翻译。此外，pET-28a()在N端含有His.Tag寡聚组氨酸链的同时,C端也具有可选的His.Tag，因此,表达出的融合蛋白在多种情况下都可以便利地和经济地进行纯化。我们在运用BL21(DE3)/pET-28a()体系高效地表达了rh-leptin的基础上，获得了主要以包涵体形式存在（50）的rh-leptin融合蛋白。将包涵体以0.1%Triton-100洗涤后用SKL溶解，进一步浓缩

26、后，得到了高纯度有免疫学活性的目的蛋白。在对rh-leptin生物学活性鉴定时，选用了两种动物实验模型。经典的小鼠减肥及进食量抑制实验9，Leptin作为一种脂肪组织与下丘脑之间的信号传导蛋白对维持体内正常的脂肪水平及调节进食起着重要的作用10。给予外源性rh-leptin后显著抑制了小鼠的体重及进食量增长。本实验选用20g的Km小鼠，正处于生长发育期。但通过与对照组比较，rh-leptin对小鼠进食和体重增长的抑制作用仍清晰可见；小鼠胃肠推进率测定模型实验， leptin可通过迷走胆碱能神经和胆囊收缩素A（CCK-A）介导的作用持续性抑制胃运动，影响食物排空，导致胃肠推进率降低11，12。本

27、文观察到给予rh-leptin组小鼠的胃肠推进速率降低，与对照组相比有显著性差异。 综上所述，本实验重组表达了rh-leptin，建立了其分离纯化技术，获得了高纯度的具有免疫学和生物学活性的rh-leptin蛋白，为进一步开展leptin的临床和基础研究奠定了基础。参考文献: 1 Kelesidis T, Mantzoros C S. The emerging role of leptin in humansJ. Pediatr Endocrinol Rev, 2006, 3(3):239-248.2 Zhang Y, Proenca R, Maffei M, et al. Positiona

28、l cloning of the mouse obese gene and its human homologueJ. Nature,1994,372 (6505):425-432. 3石燕，颜光涛，林季. 探讨急性应激因子诱导Leptin水平降低J. 标记免疫分析与临床，2004,11(4):215-219.4 李宏睿，孙文夏. 瘦素功能研究进展J. 中国动脉硬化杂志,2004,12:108-112.5 Paraskevas K I , Liapis C D, Mikhailidis D P. Leptin: a promising therapeutic target with pleiotropic action b