RNA干扰技术在消化系肿瘤基因治疗中的应用

1、RNA干扰技术在消化系肿瘤基因治疗中的应用         11-03-24 16:25:00     作者：刘勇攀     编辑：studa20【关键词】  RNA干扰 小干涉RNA 消化系肿瘤 基因治疗     RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由内源性或外源性双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）所诱发，高度特异性降解细胞内同源mR

2、NA，使基因沉默的现象。这种现象发生在转录后水平，故又称为转录后基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS）1。RNAi是生物体在进化过程中抵御病毒入侵，抑制由转座子移动或重复序列的积累引起的基因组不稳定的保护机制，另外还是基因表达调控的一条重要途径。小干涉RNA（small interfering RNA，siRNA）是指干涉RNAi过程中在细胞内产生的长约2123核苷酸（nt）的小双链RNA分子，是RNAi发挥功能的重要中间效能分子。RNAi自从1998年发现以来，就以其独特的优势在功能基因组学研究中迅速占有一席之地，迄今已成为基因研究中不可或

3、缺的工具之一，并且随着对其作用机制的逐步了解和应用技术的日渐成熟，已开始应用于疾病防治等多个方面。本文就其机制，主要特征，以及在消化系肿瘤中的研究作一简单综述。    1  作用机制及主要特征    1.1  作用机制    RNAi在哺乳动物细胞中有两种作用机制：一种是大于30 nt的长双链RNA（dsRNA）产生的广泛的、非特异性效应。其机制可能是激活了细胞内的蛋白激酶R和RNA酶L，从而导致了非特异性的细胞凋亡。另一种是2123 nt的短双链RNA（siRNA）产生的相对具体的、

4、特异性效应。目前，RNAi在抗病毒及肿瘤中的研究主要集中在siRNA产生的特异性效应，故下面主要介绍siRNA的作用机制。    siRNA的作用机制目前尚未完全阐明，但已基本达成共识，即dsRNA在细胞内与DICER酶（一种RNAaseIII家族中特异性识别dsRNA的酶）结合，随即被分割成2123个核苷酸的短链dsRNA，在这个过程中需要ATP的参与。分割下来的短链dsRNA即为siRNA，它是RNAi的起始诱导物，与DICER酶形成RNA引导的沉默复合体（RISC），此时RISC无活性，随后，siRNA经历一个依赖ATP的解双链过程激活RISC2。siRNA

5、特异性地识别靶基因转录的mRNA，并引导RISC结合mRNA，RISC中的DICER酶将mRNA切割成2123个核苷酸片段，此后mRNA被逐步降解，导致不能进行翻译过程，从而引起目的基因沉默，抑制靶基因的表达。新产生的dsRNA（siRNA）可继续形成RISC复合物进入新一轮RNAi的循环，产生正反馈效应。这一过程需在RNA依赖RNA聚合酶（RdRP）的条件下进行。除上述机制外，转基因真核生物dsRNA 还可引起相应基因的甲基化，促使异常RNA产生，最终导致基因沉默3,4。    1.2  主要特征    2  R

6、NAi在消化系肿瘤治疗中的应用    肿瘤的发生、发展与原癌基因的激活，抑癌基因的失活，以及凋亡相关基因的异常表达等均有密切的关系。因此我们可以针对这些因素，利用RNAi相关技术在不影响正常基因功能的条件下抑制突变基因表达或基因的表达过量，从而达到基因治疗的目的。另外，肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果，当单一癌基因的阻断不能完全抑制或逆转时，可以设计一种针对同一家族多个基因的保守序列的siRNA分子，便可以同时抑制这一家族的多个基因表达，且抑制效果互不干扰。    2.1  原癌基因  

7、0; 原癌基因是细胞基因组内正常的组成成分，自然状态下无致癌作用，其主要作用是通过编码生长因子等调节正常细胞的生长、分化。原癌基因激活是肿瘤发生的根本原因之一，因此，如何抑制原癌基因的激活成为目前研究肿瘤治疗的热点之一。    2.2  抑癌基因    由于抑癌基因在细胞增殖调控中起重要作用，因此也成为基因治疗的重要目标之一。p53基因是最早利用RNAi技术研究的基因之一，人体内大约50%肿瘤的发生是p53基因突变的结果。p53基因能够抑制DNA合成及诱导DNA修复来抑制细胞生长，使细胞停滞在G1期。突变型p53失去对细胞增

8、殖的负调控作用，导致细胞增殖失控发生癌变。Martinez等8的报道中，将H1299细胞转染野生型p53和突变型p53的RNA表达型质粒，结果，野生型siRNA明显抑制野生型p53蛋白的表达，对突变型几乎无效；而突变型siRNA显著抑制突变型p53蛋白表达，野生型基因则不受影响。由此证明，RNA序列能特异性地分别抑制这两个基因的表达，并且对突变型p53的抑制可在一定程度上恢复野生型基因的表达和功能。这就为选择性和个体化治疗肿瘤提供了可能。    2.3  细胞凋亡相关基因    细胞增殖和凋亡之间的动态平衡对于机体的生长发育有着举足轻重的影响。凋亡过程的失调可能导致肿瘤的发生。有研究表明9，将表达有绿色荧光蛋白(GFP)的BclXLsiRNA转染人胃癌细胞株MGC803，用RTPCR和免疫荧光法检测BclXL的表达，48 h后发现，与siRNA阴性组相比，实验组GFP明显减少，BclXL蛋白和B