病毒与非病毒介导的绿色荧光蛋白基因转导的比较研究

1、    病毒与非病毒介导的绿色荧光蛋白基因转导的比较研究        自1992年绿色荧光蛋白(GFP)基因的cDNA被成功克隆以来，由于GFP结构稳定、在受到蓝光或紫外光照射时可自发发出绿色荧光，而这一过程不需要其他共刺激因子、底物或其他基因产物的协助，故在生物医学领域的应用日益广泛1，2。因此，深入研究各种基因转导方法在GFP基因转导方面的效率及优缺点、分析GFP对细胞生长速度和生物学行为的影响等，对于合理应用GFP十分重要。 一、材料与方法1.重组质粒：GFP真核表达

2、质粒pEGFP-N1购自Clontech公司。GFP重组逆转录病毒质粒pLNCX-EGFP是我们自己构建的。来自pEGFP-N1、编码增强型GFP的cDNA片段经Hind 和Not 酶切及电泳分离后，由DNA聚合酶Pfu补齐成平头，然后插入逆转录病毒载体pLNCX(购自Clontech公司)的多克隆位点Hpa 处。另一组质粒pHook2-lacZ（购自Invitrogen公司）的结构与pEGFP-N1相似。我们用编码增强型GFP的cDNA片段取代lacZ基因构建了pHook2-EGFP。上述各种质粒中lacZ和GFP基因的表达均受人巨细胞病毒即刻早期抗原基因（CMV）启动子调控，neo基因的表

3、达受SV40启动子控制。2.细胞系：GFP逆转录病毒的包装采用Phoenix逆转录病毒包装细胞系， GFP腺病毒的扩增采用人胚胎肾细胞系293。病毒与非病毒介导的GFP基因转移试验采用大鼠乳腺癌细胞系R3230AC和小鼠乳腺癌细胞系4T1。新霉素(neo)抗性克隆的筛选及持续培养采用400 g/ml G418。3.GFP逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒的制备：生长至80%90%密度的逆转录病毒包装细胞经胰蛋白酶消化后，按1×107/ml重悬于无血清的DMEM细胞培养液内。重组逆转录病毒质粒pLNCX-EGFP的转染采用电穿孔技术，每次电穿孔采用400 l细胞悬液和20 g质粒DNA。电

4、穿孔仪为BTX公司产品，各项参数按厂家推荐设置。转染后4872 h收集含有逆转录病毒颗粒的上清液，离心后-80储存。一般情况下逆转录病毒的滴度为105 cfu/ml(GFP腺病毒由Dr. Borreli和Dr. Corry赠送，GFP腺相关病毒由Dr. Samulski赠送)。4.GFP逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒的感染：GFP逆转录病毒感染：于感染的前1 d将1×106肿瘤细胞接种于10 cm细胞培养皿中，至细胞达到50%60%的密度时，将含病毒颗粒的上清液与聚季胺盐混合（终浓度为4 g/ml），按每个细胞15 moi.加入细胞培养液中，感染624 h，然后更换新鲜培养液，24

5、h后检测GFP感染效率3。GFP腺病毒感染：按平均每个细胞100 pfu加入R3230AC和4T1细胞培养盘中，腺病毒感染持续30 min，漂洗细胞后更换新鲜培养液，24 h后检测GFP感染效率4。GFP腺相关病毒感染：先用无血清的Opti-MEN 培养液漂洗细胞一次，按每个细胞1001 000 pfu，先将GFP腺相关病毒与2 ml Opti-MEN 培养液混合，再加入细胞培养盘内，37过夜。次日改换含血清的新鲜培养液，24 h后检测GFP感染效率5。5.脂质体介导的GFP基因转染，以及持续、高效、稳定表达GFP 的肿瘤细胞系：转染的前1 d将1×106个肿瘤细胞接种于10 cm细

6、胞培养盘内。转染时先分别将5 g pEGFP-N1质粒DNA及10 l DMRIE脂质体（Gibco-BRL公司）加入到1 ml Opti-MEN 无血清培养液内，混合，室温放置3045 min。进一步与2 ml Opti-MEN 混合，然后加入经无血清培养液漂洗过的细胞中，37孵育5 h。此后加入等体积含20%胎牛血清的Opti-MEN ，37过夜。次日更换成正常的细胞培养液，24 h后检测GFP感染效率。表达GFP的肿瘤细胞系由G418筛选获得。于质粒DNA转染后第2 d先用胰蛋白酶消化，按150将细胞接种于含G418的细胞培养液内，2周后荧光显微镜下选择表达GFP的抗性克隆，进一步在96

7、孔板中亚克隆。6.感染或转染后的细胞GFP表达的检测：感染或转染后的细胞是否表达GFP，表达的强弱，以及细胞形态、生长方式有无改变等的观察采用Zeizz Axioskope显微镜及FITC滤光片。像经与显微镜连接的照相装置采集后，由计算机储存并分析。GFP阳性细胞的分析与分选、表达水平的检测等采用BD公司FACStar流式细胞仪，激发光源采用488 nm氩离子激光。细胞生长速度参照细胞群体倍增时间，分别将稳定表达GFP的细胞与未转染GFP的亲代细胞按2×104接种于6孔板中，于24、48、72、96、120及148 h胰蛋白酶消化，Coulter Z2 Particle Count

8、Size Analysis仪计数细胞。7.表达-半乳糖苷酶的细胞的染色分析：细胞经pHook2-lacZ质粒DNA转染、G418选择23周后，抗性克隆先用4%甲醛固定10 min，然后与X-gal染色液孵育过夜。X-gal染色液包含1 mg/ml X-gal、4 mmol/L K3Fe(CN)6、4 mmol/LK4Fe(CN)4-3H2O 、2 mmol/L MgCl2。计数蓝色克隆数目。二、结果1.病毒及非病毒介导的GFP基因转导效率及表达情况比较：GFP逆转录病毒感染大鼠乳腺癌细胞系R3230AC，通常2 d以后方可见GFP表达。表达GFP的细胞其亮度比较均匀，但较弱。逆转录病毒介导的G

9、FP基因转导效率依逆转录病毒的滴度和细胞生长状态差异较大，变化在20%80% 之间。但感染后的细胞可长期持续表达GFP。GFP腺病毒以平均一个细胞100 pfu感染R3230AC细胞，56 h后即可见明显的GFP表达，几乎100%的细胞可被感染。受腺病毒感染的细胞GFP表达程度很不均一，有的很亮，FACS分析其亮度超过对照4个数量级。不过腺病毒介导的GFP基因转导其表达时间较短，通常仅持续高水平表达1周左右，然后逐渐降低，3周后几乎完全消失。GFP腺相关病毒感染R3230AC细胞后2 d出现GFP表达，但对R3230AC细胞的感染能力很低，即使按1001 000 pfu感染R3230AC细胞，

10、仅1%左右表达GFP。脂质体介导pEGFP-N1质粒DNA转染R3230AC细胞，于转染后6 h可见GFP表达，24 h达到高峰，以后逐渐下降，如果不加任何选择压力，1周后完全消失。在最佳条件下GFP质粒DNA的转染效率可以达到50%以上，GFP的表达程度也很不均一，可见到很亮和较弱的细胞（14）。1未经GFP基因转移的大鼠乳腺癌细胞系透射光下观察2脂质体介导的GFP基因转移荧光显微镜下观察3逆转录病毒介导的GFP基因转移荧光显微镜下观察4腺病毒介导的GFP基因转移荧光显微镜下观察14经不同病毒和脂质体介导GFP基因转移的大鼠乳腺癌细胞系GFP表达情况×4002.GFP表达对细胞生长

11、速度及生物学行为的影响：R3230AC细胞经质粒pEGFP-N1转染及G418选择后，其抗性克隆中70%完全看不见GFP表达，GFP阳性克隆间其GFP的表达量差别也很大，即使在同一个克隆中，表达有时也不均一。为了深入研究GFP表达效率降低是否因GFP对宿主细胞有毒性所致，我们对比分析了pHook2-EGFP及pHook2-LacZ抗性克隆中GFP与LacZ基因的表达情况。结果是经pHook2-LacZ转染的细胞G418抗性克隆中65%(165个克隆中的103个）X-gal染色呈阳性，而pHook2-EGFP转染的细胞G418抗性克隆中仅18（76个克隆中的14个）荧光显微镜下呈绿色。此外，GF

12、P阳性克隆中表达水平特别高的细胞常常变小变圆，倾向于脱离细胞培养盘，这在腺病毒及脂质体介导的GFP基因转移的细胞中尤其明显。对4个表达GFP的阳性克隆的细胞生长速度进行检测，其中3个的群体倍增时间（24 h）与亲代未转染GFP的细胞无明显差异，1个表达水平特别高的克隆其细胞的生长速度减慢，其群体倍增时间增加到27 h。GFP阳性肿瘤细胞在动物体内可继续生长形成肿瘤并持续表达GFP。三、讨论根据我们的实验结果，病毒与非病毒基因转导方法均可介导GFP 基因转移。腺相关病毒的宿主范围较窄，对我们所采用的几种肿瘤细胞系的转染效率均极低。脂质体介导的GFP质粒DNA转染可以获得较高的转导效率，可高达50

13、%以上。逆转录病毒和腺病毒其宿主范围较广，对肿瘤细胞的基因转导效率均较高，能有效转导各种类型的细胞，且适量的GFP表达对细胞的生长速度和生物学行为没有明显影响，表达GFP 的细胞不需任何处理即可在荧光显微镜下清晰显示或被流式细胞仪所检测，为今后研究基因表达，特别是监测各种基因表达载体在活体内的分布，以及组织和器官靶向传递等提供了有效的工具。GFP也存在缺点：（1）GFP的表达不够稳定，Hanazono等3认为GFP基因不稳定，容易发生重排。（2）要分离到持续、高效、稳定表达GFP的克隆比较困难。（3）当GFP特别高水平表达时，细胞的生长速度和生物学行为会发生一定的变化，提示过高水平的GFP对细

14、胞仍然具有一定的毒性。为了深入探讨GFP不表达的原因，我们对比观察了pHook2-EGFP与pHook2-lacZ转染的细胞中GFP和LacZ基因的表达情况，虽然后者G418抗性克隆中X-gal染色阳性克隆的百分比明显高于GFP阳性克隆，但仍然只有65%。有人曾用单克隆抗体免疫组织化学染色与X-gal染色对比分析LacZ基因转染效率，发现有的克隆尽管成功转移了基因，也有表达，但只有有活性的-gal才能被X-gal显示6。因此，G418抗性克隆中检测不到绿色荧光除上述GFP基因重排外，也可能是由于GFP缺乏活性、或是表达量很低不易被常规采用的检测方法所显示。（本文编辑：齐文安）作者单位：黄倩（2

15、00080 上海市第一人民医院中心实验室）李川源（Department of Radiation Oncology, Duke University Medical Center, U S A）参考文献1，Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science, 1994,263:802-805.2，Cheng L, Fu J, Tsukamoto A, et al. Use of green fluorescent protein vari

16、ants to monitor gene transfer and expression in mammalian cells. Nat Biotechnol, 1996,14:606-609.3，Hanazono Y, Yu JM, Dunbar CE, et al. Green fluorescent protein retroviral vectors: low titer and high recombination frequency suggest a selective disadvantage. Hum Gene Ther, 1997,8:1313-1319.4，de Martin R, Raidl M, Hofer E, et al. Adenovirus-mediated expression of green fluorescent protein. Gene Ther, 1997, 4: 493-495.5，Peel AL, Zolotukhin S, Schrimsher GW, et al. Efficient transduction of green fluorescent protein in spinal cord neurons using adeno-associated virus vecto