_植物内生源产普鲁兰酶细菌的筛选及其酶活性测定

1、河南科技大学本科生毕业论文植物内生源产普鲁兰酶细菌的筛选及其酶活性测定摘 要作为一种非常重要的药用植物的蒺藜，其具有很多种的药理活性，比如调血脂、降低血压、催欲、抗癌抗菌、利尿等等。现在有很多的研究方向是与蒺藜植株内主要的成分以及药理作用有关。最近几年的研究表明植物的内生菌与植物的许多药用机理有着很紧密的关系。因此本实验就以蒺藜为试验材料，经过用固体分离培养基培养其的根茎组织，分离得到14种细菌，再通过用鉴别培养基筛选出6株产普鲁兰酶的菌株，但只有一株水解圈比较大，对其编号WKX11。为了进一步测定所筛选出来的细菌的产酶情况及其所产酶的活性，本实验用了产酶培养基对试验所筛选出来的细菌所产酶进行

2、了酶活性测定。最后从本实验所培养的细菌菌液中提取DNA，对其DNA进行PCR扩增，然后将试验中获得的PCR产物在电泳液里进行凝胶电泳，电泳后获取目的条带，将目的条带克隆后进行测序，获得目标菌株的保守序列；将测序获得的序列放到NCBI数据库中比对。最后综合生物学特征和分子生物学测定结果，将目标菌株确定为Aerobacter Aerogenes。其具有产普鲁兰酶的特性，可作为产普鲁兰酶的备用菌株。关键词：普鲁兰酶，蒺藜，筛选，16SrDNAISCREENING AND PRODUCTION OF BIOGENIC ACTIVITY ASSAY PULLULANASE BACTERIA IN PLA

3、NTSABSTRACTTribulus as a very important medicinal plant, which has a wide variety of pharmacological activities, such as adjusting blood fat, lower blood pressure, aphrodisiac, anti-bacterial, diuretic and so on. There are a lot of studies and research on the pharmacological effects of the component

4、 within its plant. In recent years many studies have shown that the efficacy of plant endophyte and plants has a very close relationship. Therefore, this experiment Take terrestris as materials, after separation of the solid culture medium with its roots organization, isolated 14 kinds of bacteria,

5、and then screened by differential medium pullulanase producing strain of six, but only one hydrolysis circle is relatively large, their number WKX11. Produced and its activity measured for enzyme production in order to further filter out bacteria, this experiment with the medium on enzyme tests filt

6、er out bacteria produced the enzyme activity assay. The last extract from this experiment in broth culture bacterial DNA, PCR amplification of their DNA, and then the PCR product was obtained in the test solution in electrophoresis gel electrophoresis to obtain target band after electrophoresis, the

7、 target band after cloning and sequencing were obtained conserved sequence of the target strain; sequencing will get into the NCBI database comparison. The final consolidated morphology, biochemical and molecular biological assay results, the target strain identified as Aerobacter Aerogenes. Having

8、pullulanase producing properties, it can be used as spare production pullulanase strains.KEY WORDS:pullulanase,Tribulus,isolation,16SrDNA8目 录摘 要IABSTRACTII第一章 文献综述31.1 内生菌31.1.1 内生菌的多样性31.1.2 植物内生菌的作用31.1.3 国内外内生菌的研究进展41.2 普鲁兰酶41.2.1 普鲁兰酶的分类51.2.2 普鲁兰酶产生菌的种类51.3 普鲁兰酶的应用61.4 普鲁兰酶国内外的研究进展71.5 实验研究的目的及

9、意义71.5.1 实验目的71.5.2 实验意义7第二部分 试验部分92.1 材料与方法92.1.1 试验所用材料92.1.2 试验所用仪器92.2 试验方法92.2.1培养基的配制92.2.2材料的采集处理102.2.3内生菌的培养102.2.4划线纯化102.2.5保种112.2.6保种细菌的划线培养112.2.7酶活性鉴定112.2.8菌株的鉴定11第三部分 结果与分析133.1 试验所用产普鲁兰酶菌株的分离133.2 菌株WKX11的产普鲁兰酶活性测定133.3 菌株WKX11的鉴定143.3.1 菌株WKX11的形态特征143.3.2 WKX11菌株的生理生化鉴定153.3.3 菌株

10、ZXYG5的16S rDNA分析163 讨 论17参考文献19致 谢20第一章 文献综述1.1 内生菌内生菌指的是一类在其生活史中存健康植物各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的细菌，包括细菌、真菌、放线菌等等1。1.1.1 内生菌的多样性经过研究研究人员发现植物内生菌广泛存在，地球上30万种的植物中都广泛存在内生菌的1。而且科研人员对农作物植株内生菌的研究种类很多种，比如甜菜、牧草、马铃薯、棉花、小麦、甘蔗、玉米、柠檬等等2。截止到现在文献已经报道了在各种植物内生细菌存在于农作物以及经济作物中的种类就已经超过130种，分别属于49个属，其主要为土壤杆菌属克雷伯氏菌属、假单胞菌属、甲基杆菌肠杆菌属

11、、芽孢杆菌属、泛菌属、属等3。1.1.2 植物内生菌的作用1.1.3 国内外内生菌的研究进展在国际范围内，植物内生菌最大的研究特点就是物种范围广，多样性丰富，野生资源开发利用的潜力很大。迄今为止，约有85个属300多种植物种类中报道有内生菌的发现。在棉花、水稻、狗牙根等一些植物中也陆续发现具有丰富的内生细菌8。相比较其他种类微生物，中国的植物内生菌方面的研究起步较晚。1994年，邱德有、朱至清发表了一种云南红豆杉内生真菌的分离，开启了中国植物内生真菌研究的先河9，10。1996年，刘云霞等人发表关于水稻内生细菌巨大芽孢杆菌分布特征的相关研究11。21世纪以后，微生物内生菌的研究也逐渐得到广大科

12、研人员的重视，得到了较快的发展。大量研究文献表明，植物内生菌是一个极为特殊的微生物生存微环境，孕育的微生物资源极为丰富，是筛选多样性功能微生物野生资源良好的材料，如产淀粉酶菌株、产甘露聚糖酶菌株等13。1.2 普鲁兰酶普鲁兰酶pullulanase是一类淀粉脱支酶,可以专一性得水解普鲁兰糖，划归淀粉酶类，这种酶可以切开支链淀粉分支点处的-1，6-糖苷键，形成直链淀粉，与异淀粉酶相比较而言，普鲁兰酶能够把支链分解，可以提高淀粉的利用率，其尽管能分解分支点处的-1，6糖苷键，但是不能分解由两个或者三个葡萄糖残基形成成的侧枝。普鲁兰酶的特征是分解普鲁兰糖的最终产物是麦芽三糖。1.2.1 普鲁兰酶产生

13、菌的种类普鲁兰酶生产菌株的类型很。不同来源的菌株及酶的特性见表一。表一 不同来源的菌株以及酶的特性 注：此表中数据来源于参考文献。到现在为止，虽然已经发现了很多种能够产普鲁兰酶的微生物，但是绝大部分的野生菌种由于对其所生存的环境条件要求太高，而且其产酶的活性太低以及其酶学的分子生物学性质不稳定等，造成这些产普鲁兰酶的菌种没有太大的商业利用价值。因此，到目前为止，已经投入到工业化生产的产普鲁兰酶的菌株只有丹麦一家公司的Bacillus acidopullulyticus菌株和美国的Genencor公司的Bacillus deramificans菌株等少数的几个菌14。1.3 普鲁兰酶的应用近几年

14、普鲁兰酶的用处十分广泛，比如在提高淀粉的利用率方面、降低粮耗方面、提高产品质量以及开发新产品等方面有着巨大的价值。而且，普鲁兰酶在很多行业也有很好的应用前景，比如洗涤剂业、纺织业、医学等行业。1.4 普鲁兰酶国内外的研究进展近些年来，蛋白质工程的技术手段飞速发展。所以利用蛋白质工程技术去设计加工以获得具有高比活、以及良好的热稳定性和pH稳定性的普鲁兰酶也已经成为可能，甚至还能够设计出具有优质金属离子抗性和蛋白酶抗性。由此看来，应用蛋白质工程进行普鲁兰酶的各种开发将要成为未来发展的大趋势。开始研究普鲁兰酶到现在已经有很长的时间了。1961年，Bender和Wallenfels首次通过产气气杆菌（

15、Aerobacter Aerogenes）的发酵获得了普鲁兰酶，打开了研究普鲁兰酶领域的先河15。目前而言，在关于普鲁兰酶的研究大多都集中于产生菌的筛选，当然也取得了一定的成效。但是如果要应用于工业生产，现在发现的普鲁兰酶产生菌的菌种仍不能完全满足工业需求。并且从上文所述可知，普鲁兰酶的应用多为淀粉糖化工业，而糖化工艺的作用环境多为较高温度和弱酸性，这就为研究学者发现筛选出耐热耐酸的普鲁兰酶产生菌提出了更高的要求。由于不同来源的普鲁兰酶是由不同环境下的宿主菌所产生的，所以其酶学活性也各有差异。科学家们分别对这些来源不同的普鲁兰酶进行克隆，同事对其进行异源性表达，研究在来源不同的普鲁兰酶在不同的

16、环境条件下的结构和功能。此种研究能够进一步的解释普鲁兰酶结构和功能的对应关系16。1.5 实验研究的目的及意义1.5.1 实验目的 通过以支链淀粉为唯一碳源的分离培养和以普鲁兰糖为唯一碳源的鉴别培养基复筛，从牡丹根、茎、叶中分离得到产普鲁兰酶菌株。通过光学显微镜和扫描电子显微镜的外部形态观察、16S rDNA序列分析，最终对本实验最终筛选出来的产普鲁兰酶的目的菌株进行分类鉴定，并采取DNS法测定目的菌株所产普鲁兰酶的酶活力17。实验旨在了解和掌握产普鲁兰酶的菌株的筛选方法过程以及其特征和所产的普鲁兰酶的酶活性，为其他来源的产普鲁兰酶菌株的筛选分离及其酶活性测定提供了一些有益参考，并努力丰富高效

17、产普鲁兰酶的菌株资源库。1.5.2 实验意义无论是在医药研究方面、分子生物学研究方面还是在农业研究方面，产酶菌株的研究对这些方面的研究都有着不可估量的意义18；植物内生菌的分类有很多种，其生物学作用也都不一样，这些不同的生物学特征值得我们去钻研与探索；蒺藜作为我们生活中经常遇见的植物，如果对蒺藜植株的内生菌进行全面的研究作为将来生物技术研究的新材料。蒺藜在我们日常你生活中非常常见，它本身作用也非常重要，蒺藜的体内不仅含有丰富的化学活性物质，蒺藜植株内所含的内生菌株种类非常多，所以对蒺藜植株内的内生菌更加深入的研究很有有必要，要更好的理论结合实践，从而才能更好地开发投入使用。本实验目的就是在获得

18、单一的蒺藜植株内生源产普鲁兰酶的菌株并且对其生物学特征进行观察记录，在产酶培养基平板上对筛选出来的目标菌株并且对目标菌株的产酶酶活性测定，最后经过16S rDNA将目标菌株测序获得的DNA序列进行鉴定，以确定该菌株的菌种，并通过NCBI数据库的比对，确定其系统发育位。第二部分 试验部分2.1 材料与方法2.1.1 试验所用材料试验所用的蒺藜：采自河南科技大学周山校区。试验所用的固体分离培养基：氯化钠4.5g，蛋白胨9.0g，琼脂粉17.0g，酵母提取物5.0g，支链淀粉4.0g，蒸馏水1000ml，pH7.0。试验所用的鉴别培养基：蛋白胨5.0g，普鲁兰糖1.5g，酵母提取物3.0g，氯化钠4

19、.0g，蒸馏水1000ml，琼脂粉17.0g，pH7.0。试验所用的LB种子培养基：蛋白胨9.0g，氯化钠4.0 g，酵母粉4.0g，蒸馏水1000ml，pH7.0。试验所用的产酶培养基：普鲁兰糖3.0g，磷酸氢二钾1。0g，酵母粉9.0g，磷酸二氢钾1.0g，七水硫酸镁0.6 g，硫酸铁0.01g，蒸馏水1000ml，pH7.0。2.1.2 试验所用仪器锥形瓶、烧杯、涂布器、电泳槽、高压蒸汽灭菌锅、冰箱、恒温培养箱、平板、玻璃棒、千分之一精度天平、接种环、蜡盘、摇床、烘箱、不同规格的移液枪、无菌操作台、恒温水浴锅等。2.2 试验方法2.2.1试验所用培养基的配制取三只100ml的锥形瓶编号，

20、由于各种培养基均需要300ml，按3:10比例称取培养基的中所需要的普鲁兰糖，置于小锥形瓶中后，先加入50mL蒸馏水，配成实验所需的溶液然后将其包好，放入灭菌锅中高压蒸汽灭菌，121，20min，灭菌后取出放入60烘箱。再取三个500ml的容器并且对其做好标记，按照试验中所需要的不同种类的培养基的配方称取所需要的试剂，最后配成250ml的培养液。用搅拌器搅拌，然后缓慢地加入琼脂，然后用塞子将锥形瓶口密封，用报纸密封好。然后准备50个洗净并且烘干的培养皿，密封后和装着培养基的锥形瓶一起放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌，121，20min。灭菌后培养液自然降温，培养皿烘干。烘干后把酒精灯、记号笔、培养皿、

21、装有培养液的锥形瓶以及糖溶液放进超净工作台。打开紫外灯表面杀菌15min。灭菌完成后，戴上灭菌过的橡胶手套，并且用75酒精消毒后进入超净工作台，点燃酒精灯，将培养液倒入培养皿中，注意一定要无菌条件下将培养液倒入培养皿中，以防止杂菌污染，然后对试验所需要培养基做好标记，自然冷却后，开始倒平板。2.2.2材料的采集处理将石蜡放在石棉网上融化。把从河南科技大学周山校区采集回来健康的蒺藜植株取根还有茎，将其剪成35厘米的小段，把这些蒺藜的根和茎的两头用已经融化的石蜡封起来，然后用无菌水冲洗，冲洗之后将其放进无菌操作台内，然后同时把本实验中处理材料所用的工具全部放进超净工作台进行紫外线灭菌，打开紫外灯照

22、射灭菌15min。灭菌后戴上灭菌过的橡胶手套，用75酒精消毒后进入超净工作台中，然后剪去用石蜡处理过的蒺藜植株的根和茎的两端，然后把蒺藜的茎还有根放进消过毒的研钵中充分研磨成糊状即可。2.2.3内生菌的培养用50微升刻度的移液枪移取20微升糊状的蒺藜植株的上层清液，然后打在培养基平板的表面，之后用三角涂布器缓慢地的在培养基平板上涂平。不同的培养基至少涂5个平板，便于日后观察与使用，然后将其做好标记。然后把这些培养基平板用干净的自封袋密封好放进37恒温培养箱中培养4872h。培养后将其取出来观察培养的结果。2.2.4划线纯化取出培养基观察其上面的菌株，经过老师指导挑选出不同颜色、形状、大小等形态

23、特征的菌落对其进行编号并准备进一步的把筛选出来的单菌落划线纯化。以2:10的比例按照LB种子培养基的配方称取试剂，将其搅拌均匀配成培养液，然后倒入洗净烘干的锥形瓶中，用塞子将瓶口密封。另外取40个已经烘干过的的培养基平板用报纸密封好同锥形瓶一块放进高压蒸汽灭菌锅中灭菌，121摄氏度，20分钟。灭菌后将取出放入烘箱中，待培养液降至60，培养皿平板烘干后放进超净工作台内，打开紫外灯灭菌15min。灭菌后戴上干净的橡皮手套，然后用75酒精喷洒消毒后进入超净工作台中。点燃酒精灯，将锥形瓶内的培养液在酒精灯火焰附近倒进烘干的培养皿平板内，防止杂菌进入，等到自然冷却凝固后倒平板。将接种所用到的实验仪器以及

24、灭菌后的培养基平板放入无菌操作台中，打开紫外灯灭菌15min。紫外灯灭菌后，戴上手套点燃酒精灯，开始接种，接种环放在酒精灯火焰上灼烧，然后把筛选出来单菌落按照编号用接种环接种到到对应编号的平板培养基中划线，完成后用自封袋密封，将平板培养基放进37培养箱中培养2d。培养结束后取出观察其表面特征并且记录拍照。2.2.5保种 配制LB种子培养基。然后将密封好的装有培养液的锥形瓶放进高压蒸汽灭菌锅中灭菌，121，20min，然后将其取出放入烘箱中，到50左右时将其放进提前灭菌过的无菌工作台中。同时也把保种所需仪器也放进无菌操作台中。然后灭菌15min。将培养液在酒精灯火焰附近倒入试管中，防止空气中的杂

25、菌污染。接下来进行接种，把接种环放在酒精灯火焰上灼烧灭菌，在酒精灯火焰附近将培养的细菌的单菌落接种到试管中，作好记录。接种完成后把这些试管放在摇床中培养1d后取出。培养后将摇床中的试管取出放到无菌工作台中，同时将所用仪器以及试剂也放进无菌工作台中，灭菌15min。戴上灭菌过的橡胶手套进入无菌工作台，把酒精灯点燃，将试管中培养的菌液接到保种管中，对其编号。然后将甘油移到管中。完成后，将保种管放进盒子中密封，做好标记。冰箱中4保存。2.2.6保种细菌的划线培养将保种的细菌接种到LB种子培养基平板中放进很稳培养箱中培养2448个小时，取出观察其表面特征。注意此操作过程一定要在无菌条件下进行，防止杂菌

26、污染造成实验误差。2.2.7酶活性鉴定酶活性的鉴定：按产酶培养基配方称量试剂，配制成培养液。高压蒸汽灭菌后放进无菌操作台中，打开紫外灯灭菌15min，将培养液在酒精灯火焰附近倒入培养皿中，自然冷却倒板后将菌落接种到培养基平板中，然后培养12d。2.2.8菌株的鉴定（1）应用显微镜和电镜对该菌株进行形态观察15；（2）菌株的16S rDNA分析将WKX11菌株接种于LB液体培养基，37摄氏度，200转每分钟摇床培养12 个小时，获取菌液。采用日本生产的TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction kit Ver. 2.0 试剂盒提取WKX11基

27、因组DNA。16S rDNA PCR扩增引物以及PCR扩增体系（20 l）如下表：所需材料含量10Ex Taq PCR buffer2 ldNTP（10 mmol/ml）1.6 l正、反向引物（20 m/ml）1 lDNA模板1 lEx Taq DNA聚合酶0.2 l超纯水13.2 l正向引物27F反向引物1501F 将获得到的DNA序列提交到NCBI数据库进行比对，选取相似度最高的10株菌株来构建系统进化树菌株鉴定参考文献进行17，18。第三部分 结果与分析3.1 试验所用产普鲁兰酶菌株的分离通过用固体分离培养基的分离培养，我获得一株水解圈较大而且较显著的菌株，对其编号为WKX11；将这次筛

28、选出来的菌株WKX11通过用鉴别培养基的培养，我们更加明确的确定该菌株具有较高的讲解普鲁兰糖的活性（图1），所以我将WKX11确定为该实验最终所需的能够产所需酶的目标菌株。图1 WKX11在产酶培养基平板上的降解圈Figure 1 The Hydrolysis circle of strain WKX11 in pullulan plate3.2 菌株WKX11的产普鲁兰酶活性测定对目标菌株的WKX11菌株产酶活性的测定采用DNS法19，结果显示，在WKX11菌株的发酵产酶过程中，发酵48个小时时，普鲁兰酶活性达到最高4.3 U/ml，说明试验筛选出来的目标菌株具有很高的产普鲁兰酶活性（图2）

29、。与类似文献资料相比，不管从产普鲁兰酶活性还是从发酵周期来看，WKX11菌株都具有一定的优势，是将来研究良好的备选菌株，该菌株具备进一步开发以及应用能力。图2 WKX11菌株的普鲁兰酶活性Figure 2 The enzyme production of strain WKX113.3 菌株WKX11的鉴定3.3.1 菌株WKX11的形态特征WKX11菌株为杆型细菌，长1.23.0m，宽0.61.0m，具较小荚膜，该菌株具有运动性。37 条件下，在固体培养基上培养48个小时，该菌株形成的菌落接近圆形，整个菌落的边缘不是特别的整齐，菌落的直径大约1-3 mm，表面看上去比较平滑，菌落厚度偏薄，另

30、外，培养24小时候，开始出现红色色素（图3a）。运用扫描电镜进行显微观察时，放大到4500倍，能够清楚地观察到菌体的形态呈杆状，菌株的两端呈钝圆形；菌体的周围还生有较多的鞭毛（图3b）。图3 WKX11菌株的形态特征（a.菌落特征；b.扫描电镜下的特征）Figure 3 The general characteristics of strain WKX11（a. Colony morphology characteristics；b. The characteristics under SEM）3.3.2 WKX11菌株的生理生化鉴定WKX11菌株的生理生化测定结果表明，结果与文献中肠杆菌属（

31、Aerobacter）的描述基本一致（表1）17。表1 WKX11菌株的生物学指标测定结果Table 1 The determination results of physiological and biochemical indexes of strain WKX11测定项目结果测定项目结果革兰染色-吲哚试验-接触酶+MR试验-液化明胶-硝酸盐还原-过氧化氢酶+VP试验-注：图中“+”表示阳性；图中“-”表示阴性。 Note：“+”show positive；“-”show negative.3.3.3 菌株ZXYG5的16S rDNA分析通过测序，获得WKX11菌株的16S rDNA基因序

32、列长度为1501bp，测序结果如下：将测序获得的目标菌株WKX11的保守序列1提交NCBI（National Center for Biotechnology Information）的blast程序进行在线相似性比对，并选取与目标菌株所测得的序列相似度较高的菌株序列构建WKX11菌株的系统进化树（图4）。由系统进化树发现，目标菌株WKX11的16S rDNA序列的系统所属得可信度很高。综合菌株的形态特征、生理生化特性和分子生物学鉴定结果，将菌株WKX11归为气杆菌属Aerobacter，暂命名为Aerobacter aerogenes WKX11。 Aerobacter aerogenes strain P4（FJ417401） A