利用酶联免疫法定量检测肿瘤标志物Hsp90α

1、利用酶联免疫法定量检测肿瘤标志物Hsp90深圳职业技术学院 12药学1 XXX一、定量检测Hsp90的临床应用价值肿瘤标志物（Tumor marker，TM）是指在恶性肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞的基因表达而合成分泌的或是由机体对肿瘤反应而异常产生和升高的，反映肿瘤存在和生长的一类物质。理想的肿瘤标志物应灵敏度高，特异性好，能够明确地区分肿瘤患者与非肿瘤患者；针对某一种肿瘤，具有组织器官特异性，能对肿瘤进行定位；与病情严重程度、肿瘤大小或分期有关；能监测肿瘤治疗效果和肿瘤的复发。热休克蛋白（Heat shock proteins，Hsp）90是一个伴侣蛋白，能够辅助蛋白折叠和维持细胞内多种

2、信号传导蛋白的稳定，从而促进细胞存活和生长。在肿瘤细胞中，Hsp90能够使过度激活或突变的信号传导蛋白保持活性，加速了肿瘤细胞的恶性转变。研究发现Hsp90的分泌水平随肿瘤细胞侵袭程度的增加而升高，表明分泌型Hsp90与肿瘤的侵袭呈正相关1，随后，Hsp90作为肺癌相关肿瘤标志物被证明，可用于肺癌患者的病情监测和疗效评价2，亦可作为诊断肺癌尤其是早期肺癌诊断的参考。另外，由于目前常用的肿瘤标志物既存在于肿瘤中，也存在于正常人群和非肿瘤病人的血液和体液中，不能单凭肿瘤标志物超过参考范围确诊患癌。因此，人们期待通过“一滴血”或“一泡尿”早期确诊肿瘤的技术还有待进一步研究。二、定量检测Hsp90的背

3、景在肿瘤标志物出现之前，肺癌的诊断及肺癌患者的疗效评价常有影像学方法尤其是CT检查常用于确定肿瘤的部位、大小及与周围组织的毗邻关系，是肿瘤诊断、分期及治疗方式选择的重要依据，也可做大致的定性诊断；病理学检查，其结果准确性高，但是因为需要取得足够的组织标本用于检查，常常需要多点取材或多次取材，而且部分患者因为病变部位等原因无法成功获得组织标本，最后需行手术切除方能明确诊断，过程繁琐。支气管镜活检，对中央型肺癌的诊断结果准确，但该方法为侵袭性操作，部分患者不愿接受或不能耐受。Hsp90作为肺癌肿瘤标志物的发现，可通过酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assa

4、y，ELISA）定量检测其含量。此检测手段具价格便宜，操作简单等优点。定量检测Hsp90含量结果，能为医生制定和及时调整治疗方案提供参考，在诊断肺癌方面，由于单一的肿瘤标志物检测结果并不理想，目前尚不能满足临床需要，为提高检测的特异性、敏感度及准确性，常采用多种肿瘤标志物联合诊断的方式。而Hsp90定量检测试剂盒的准确率高于目前常用的两种肺癌肿瘤标志物检测试剂2，其也是诊断肺癌的参考指标，且随着研究的深入，该方法未来通过单一定量检测Hsp90来确诊肺癌。三、酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验是先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。测定时，将待测样本和酶标抗原或抗体按不同步骤

5、与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。洗去多余抗原-抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。以双抗体夹心法为例，基本过程如图1所示。图1酶联免疫吸附试验过程（一）双抗体夹心法（Double antibody sandwich，DAS-ELISA）双抗体夹心法，属于非竞争结合测定。它是检测抗原最常用的ELISA，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。其基本工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体

6、的量相对于待测抗原是过量的,因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比（在方法可检测范围内）。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成有色物质，通过测定其O.D值，即可确定待测抗原含量。若固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个不同的抗原决定簇结合，则属于双位点夹心法。若采用固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合，则是双抗原夹心法。（二）间接法（Indirect ELISA）此法是检测抗体最常用的方法，其原理是将特异性抗原吸附到固相载体上，加入待测样本（含相应抗体）与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗球蛋白抗体（酶标抗体）和底物进行测定。此法是测定抗体最常用的方法,

7、属非竞争结合试验。其原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗（针对受检抗体的抗体，如羊抗人IgG抗体）与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。（三）竞争法（Competing ELISA）此法用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，将抗体吸附到固相载体上，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量成反比。竞争法ELISA可用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行检测。其方法和特点是：酶标记抗原（抗体）与样品或标准体中的非标记抗

8、原或抗体具有相同的与固相抗体（抗原）结合的能力；反应体系中，固相抗体（抗原）和酶标抗原（抗体）是固定限量，且前者的结合位点少于酶标记与非标记抗原（抗体）的分子量和；免疫反应后，结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原（抗体）的量（酶活性）与样品或标准品中非标记抗原（抗体）的浓度成反比。间接法与竞争法的ELISA形式如图2所示。图2（四）其他ELISA随着ELISA在方法学上的改进和衍化，使其不断有各具特点的新测定法问世，如应用生物素-亲和素放大系统（Biotin avidin system，BAS）的ELISA；利用酶催化底物发荧光的酶联免疫荧光测定（Enzyme linked immuno

9、fluorecence，ELFIA）；斑点-ELISA（Dot-ELISA）和酶联免疫电转移印迹法（Enzyme linked immunoelectrotransfer blot，ELTB）以及酶联免疫化学发光测定（Enzyme linked immunochemiluminescence assay，ELICLA）等。四、利用酶联免疫吸附试验定量检测Hsp90的流程酶联免疫吸附试验定量检测Hsp90过程如图3。图3利用酶联免疫吸附试验定量检测Hsp90的流程图五、利用酶联免疫吸附试验定量检测Hsp90的过程（一）Hsp90单克隆抗体制备使用Hsp90蛋白免疫小鼠，初次免疫使用抗原100g加

10、福氏完全佐剂背部皮下多点注射；3周后第二次免疫，剂量同上，加福氏不完全佐剂腹腔内注射；再过3周后第三次免疫，剂量同上；另3周后加强免疫，剂量200g，腹腔内注射。3天后取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，使用HAT进行筛选，有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化，免疫印迹和ELISA的方法进行鉴定，最终得到分泌特异性识别Hsp90的鼠源抗体的杂交瘤细胞株。根据相同步骤使用Hsp90蛋白免疫兔子，最终得到分泌特异性识别Hsp90的兔源抗体的杂交瘤细胞株。（二）酶标抗体利用戊二醛二步法3制备辣根过氧化物酶（Horse radish peroxidase，HRP）标记兔源Hsp90抗体：第一步，酶液中加戊二醛使其浓

11、度为1.25%，室温放置一段时间。过SephadexG-25层析柱（60×0.9cm）除去多余的戊二醛，收集棕色部分已活化的酶液，浓缩至适量体积；第二步，加提纯的兔源Hsp90抗体于上述活化酶液中，再加1mol/L碳酸氢钠缓冲液pH9.5，在4放置一天。然后加赖氨酸（以阻断残余的醛根），室温放置一段时间，对0.01mol/L PBS（Phosphate Buffered Saline，磷酸盐缓冲液），pH7.5，4透析过夜。得酶标抗体，经纯化后分装，-20保存备用。（三）固定Hsp90抗体用包被缓冲液将鼠源Hsp90抗体稀释至10g/mL，在96孔微孔板中每孔加入适量体积，于4

12、86;C下包被过夜。用PBST（Twain buffer phosphate，磷酸盐吐温缓冲液）洗涤96孔板3次，PBS洗涤1次。用封闭缓冲液于37ºC下封闭一段时间。再将96孔板倒置于吸水纸上，轻拍板去除板内残余洗涤液。得到固定好Hsp90抗体的酶标板。（四）标准品及待测样上样用抗体稀释液梯度稀释Hsp90校准品以做标准曲线：每个浓度设2个复孔，分别加入酶标板中。同时用抗体稀释液将待测血浆样品稀释10倍，分别加入酶标板中，每孔加入适量体积，每个样品设3个复孔。于37ºC孵育一段时间。使固相抗原与加入的抗体充分结合。孵育结束后，用PBST洗涤酶标板3次，PBS洗涤1次，洗去

13、未与固相抗原结合的抗体及其他杂质，将酶标板倒置于吸水纸上，轻拍板去除残余洗涤液。（五）加酶标抗体及显色液用抗体稀释液稀释前述制备的辣根过氧化物酶标记的Hsp90抗体，加入酶标板中，每孔加入适量体积。37ºC下孵育一段时间。PBST洗涤酶标板3次，PBS洗涤1次。在酶标板中加入3，3，5，5-四甲基联苯胺（3，3，5，5-Tetra methyl benzidine，TMB）和双氧水，避光反应。（六）终止反应后测定吸光值H2SO4终止反应。用紫外分光光度计设定好程序，在=380nm3处检测吸光值。通过Hsp90校准品浓度及吸光值绘制出标准曲线，然后测出检测样品O.D值，根据标准曲线及稀释倍数计算出待测样中Hsp90的含量。综上所述，酶联免疫吸附法具有设备价格便宜、折旧损耗小、操作简单等优点，且其检测准确性高，是一种良好的用于检测抗原、抗体物质的方法。用于肿瘤标志物的定量检测能很好的反映肿瘤标志物在体内的含量，采用酶联免疫吸附法定量检测Hsp90含量，为医生在肺癌患者的病情监测和用药选择上提供了参考。同时，利用酶联免疫吸附法定量检测的准确性并随着对肿瘤标志物研究的深入，使得未来通过定量检测单一肿瘤标志物早期快速确诊肿瘤成为可能。参考文献1 Xiaofeng Wang，Xiaomin Song，Wei Zhou，et al. The regulatory mechanism