猪流性腹泻腹泻病毒的假病毒相关研究

1、前言猪流行性腹泻假病毒的研究摘 要 猪流行性腹泻病毒（PEDV）属于冠状病毒属，冠状病毒科，能够导致仔猪严重腹泻，给养猪业带来重大的经济损失。S蛋白作为PEDV最主要的膜蛋白，已有报道证实S蛋白含有病毒感染细胞的抗原表位区，但关于S蛋白介导PEDV进入细胞还有待于进一步研究，故本主要通过构建PEDV S1的伪型病毒研究富含抗原表位区的S1蛋白在PEDV进入细胞中的作用。 本研究中，首先，为有效的检测PEDV，利用Vero E6繁殖的PEDV做为抗原，制备PEDV全病毒多克隆抗体。利用ELISA和间接免疫荧光对抗体的效价和特异性进行检测，结果显示该多克隆抗体与PEDV有很好的特异性反应。其次，为

2、研究PEDV的感染特性，摒弃非同源细胞系，对PEDV在猪小肠上皮细胞（IEC）上进行适应培养，通过在IEC细胞中盲传10代，对第10代病毒液进行检测。反转录PCR、间接免疫荧光和电镜检查均证实PEDV能够感染IEC细胞系，并稳定传代，故最终确定IEC是PEDV的易感细胞系。再次，为研究PEDV S1蛋白功能，构建S1蛋白的真核表达质粒，建立稳定表达S1蛋白的BHK-21细胞系，命名为BHK-S1。反转录PCR和间接免疫荧光鉴定，成功构建了BHK-S1稳定细胞系。利用BHK-S1稳定细胞系和重组的VSV系统，成功制备PEDV的伪型病毒VSVG*S1。反转录PCR和激光共聚焦检测结果显示，重组病毒

3、构建成功。最后，为研究S1蛋白在VSVG*S1感染IEC细胞中的作用，对感染VSVG*S1的IEC细胞中的S1蛋白进行动态定位。激光共聚焦结果显示，S1蛋白在病毒感染IEC细胞系的吸附和进入过程中发挥关键作用。本研究为进一步检测PEDV提供了有效实用的实验材料，为研究PEDV的感染特性和探索S1蛋白在PEDV感染细胞时的作用提供了参考。关键词：猪流行性腹泻病毒；易感细胞系；稳定表达系；假病毒；感染特性1 猪流行性腹泻病毒1.1 PEDV的根源猪流行性腹泻病毒（PEDV）从属于冠状病毒科，冠状病毒属，是单链，有包膜的RNA病毒，与其他冠状病毒类似，其病毒粒子形态呈多形性，大多数类似球形，大小平均

4、为130 nm，外有囊膜，纤突呈花瓣状，纤突大小介于18-23 nm，呈放射分布，病毒粒子的中央称为电子不透明区。然而，人们对于病毒内部的了解甚少。在欧洲，青年种猪，育肥猪和架子猪主要被猪流行性腹泻病毒感染。而在我国，猪流行性腹泻病毒感染多个年龄的猪群1。冬季，由于猪流行性腹泻病毒引起的病毒性腹泻，母猪以及哺乳仔猪感染该病毒几率较低于育肥猪和保育猪群2。该腹泻病毒引起的腹泻病的临床症状大都表现为感染猪食欲废绝或者减退，精神不振，眼窝下陷，明显的全身脱水，水样腹泻，伴有呕吐，其粪便稀少，颜色呈灰黄色或者黄色，腹泻时间3-4天后，病猪将会由于脱水过重而死亡。猪流行性腹泻与猪传染性胃肠炎(TGE)

5、的临床症状较为相似。二者相比，前者传播较慢，但持续时间较长，腹泻的程度与后者相比也较轻3。于1971年，猪流行性腹泻首次在英国发现4。由Debouck等成功分离得到猪流行性腹泻病毒则在1978年，将之定名CV777。随后关于该病毒在多个国家被相继报道6，尤其在美国、韩国和朝鲜等。因为该病毒将近传遍欧洲，有学者将该病叫做“流行性病毒性腹泻(EVD)”，于1976年，首次报道了与猪传染性胃肠炎相似的，可以危害哺乳仔猪的急性腹泻。人们为了排除已知的肠道致病性病原以及猪传染性胃肠炎病毒，故将该病亦称为“EVDII型”，为了和早期发现的”EVD型I”分开。直至20世纪的80年代初，各国学者证实此两种引起

6、病毒性腹泻的病原都是同一种冠状病毒，此后，一致命名为“猪流行性腹泻(PED)”5。1.2 PED流行病学 自1978年在比利时首次分离得到PEDV后，从20世纪的80年代到90年代，该病在欧洲大面积爆发，包括荷兰、英国以及瑞士等。然而，在亚洲的爆发更为严重，中国、泰国、韩国以及日本尤为明显。随后，于2012年，该病在美国多个州盛行，包括科罗拉多州、爱荷华州和明尼苏达州等。大部分的爆发集中在10日龄的仔猪，日前，PED仍在世界范围内呈大面积流行，给各地养猪业带来不同程度的损失。1.3 PEDV基因结构PEDV结构为有包膜，单股正链的线性RNA病毒，与其他冠状病毒成员相似。基因组全长2695032

7、950 nt，5端含有一个帽子结构（cap），3端含有一个Poly（A）尾巴，且其3端和3端分别包含一个非翻译区（5UTR和3UTR）。目前已发现的7个开放阅读框从5端到3端的顺序依次为：ORFla（1100013000 nt）、ORFlb（80009000 nt）、S基因（41004250 nt）、ORF3基因（650720 nt）、M基因（660730 nt）、E基因（220245 nt）、N基因（12601450 nt），其中共编码四个结构蛋白，分别为纤突蛋白（S基因）、小膜蛋白（E基因）、膜糖蛋白（M基因）、核衣壳蛋白（N基因），和三个非结构蛋白，分别为复制酶多聚蛋白1a/1b和ORF

8、3蛋白。复制酶多聚蛋白基因由两大开放阅读框构成（ORF1a和ORF1b），占5端，覆盖近全长的三分之二，位于编码四种主要结构蛋白的基因上游。1.4 PEDV主要结构蛋白功能PEDV的主要结构蛋白有四种，分别是纤突蛋白（S蛋白）、膜糖蛋白（M蛋白）、核衣壳蛋白（N蛋白）、小膜蛋白（E蛋白）。S蛋白是一种存在于病毒粒子表面、组成病毒囊膜的重要结构蛋白，分子质量150220kDa，由1383个氨基酸构成，包含多个糖基化位点，属于I型糖蛋白7、18。冠状病毒的S蛋白大都具有相近的功能和结构特点，根据其保守序列的相似性， PEDV的S蛋白被分为两个结构域：S1区（1789 aa）和S2（7901383

9、aa）14。有研究者将S1区人为的划分成两个区域：第一个区域为N端的250个氨基酸残基；其余部分为第二个区域，其中有90个残基，因与其他冠状病毒相比具有较大的差异性，被认为极有可能成为PEDV的特异性抗原决定簇7、10-12。S蛋白能够调节细胞表面受体与病毒粒子的结合，从而在病毒入侵中发挥关键作用，同时在刺激宿主免疫介导产生中和抗体过程中扮演重要角色12-15。在2005年，有研究者将S蛋白的中和表位以无烟碱烟草植物为载体进行表达，并用表达产物免疫仔猪，结果证实获得的高效表达的蛋白具有较好的免疫原性。2006 年孙东波9等利用 fd 丝状噬菌体展示技术研究分析了 PEDV S 蛋白抗原表位的免

10、疫优势区，结果得出三个抗原表位区： S1P1（248280 aa）、S1P2（442499 aa）和 S1P3（697742 aa），该研究结果为PED诊断方法的建立以及开发新疫苗提供了新的思路和理论依据。M蛋白大量存在PEDV囊膜中，是装配病毒粒子时所必须的重要结构蛋白，是由226个氨基酸组成的多肽，分子质量约为2031 kDa。M蛋白为跨膜蛋白，由三个结构域组成：位于膜内的大的C末端、位于膜外的短小糖基化N末端及螺旋区。M蛋白也在免疫介导过程中发挥重要作用，能够刺激机体产生-干扰素及中和病毒粒子的抗体16-18。当补体存在时，抗M蛋白囊膜外抗原表位的单克隆抗体具有良好的抑制病毒感染的能力1

11、9。N蛋白与病毒RNA相互缠绕，是病毒核衣壳的重要成分。由441个氨基酸组成，分子质量为58 kDa左右。在猪感染PEDV 的早期，就有大量的抗N蛋白抗体产生，同时编码N蛋白的序列高度保守，使得N蛋白拥有良好的免疫原性，因此N蛋白是用作PEDV早期精确诊断的理想靶蛋白。E蛋白是最小的结构蛋白，位于病毒囊膜上。由76个氨基酸构成，分子质量仅约8 kDa。目前针对E蛋白的研究表明，E蛋白对于包膜形成、病毒的形状形成、出芽过程、病毒复制、以及诱导细胞凋亡有决定性作用20。1.5 PEDV非结构蛋白功能复制酶多聚蛋白1a/1b是分别由开放阅读框ORF1a和开放阅读框ORF1b编码的非结构蛋白，大小约7

12、53.06 kDa（复制酶多聚蛋白1a 约452.82 kDa，复制酶多聚蛋白1b约300.24 kDa）。目前已证实，在PEDV入侵宿主细胞的过程中，复制酶多聚蛋白1a/1b在入侵早期能够发挥重要作用21。开放阅读框ORF3编码的ORF3蛋白是一种与膜糖蛋白（M蛋白）相近的非结构蛋白，位于病毒包膜的小膜蛋白（E蛋白）与纤突蛋白（S蛋白）间隙中，分子质量约25.5 kDa，尾部含有六个His。ORF3蛋白是PEDV的辅助蛋白，被认为能够对病毒的毒力产生较大的影响，可被用作分子标记来判断病毒毒力衰减以及对细胞培养的适应性22-23。ORF3基因具有多态性，存在至少3个可变区，还包括核苷酸的一段短

13、缺失（27 bp），所以ORF3蛋白的生物学意义仍有待于进一步的研究。1.6 PEDV细胞表面受体研究进展哺乳动物的氨肽酶N（aminopeptidase N，APN，CD13）是一种型细胞表面金属蛋白酶，其外部结构域糖基化程度较高，而且活性部位有一个锌离子24。目前，APN被认为是几种群冠状病毒的细胞表面受体，包括猪传染性胃肠炎病毒、人类冠状病毒229E和猫冠状病毒25-27，而关于猪氨肽酶N（porcine aminopeptidase N，pAPN）是否参与PEDV感染过程的研究较少。Oh JS等28在2003年证实，兔源抗pAPN多克隆抗体能够抑制PEDV与pAPN蛋白的结合，并且，用

14、可溶性pAPN蛋白预处理的Vero E6细胞培养病毒可以增强病毒的感染力。pAPN是一种大小约150 kDa的糖基化蛋白，大量存在于小肠黏膜上28-29。Li BX等30于2007年证明，表达pAPN的MDCK细胞（一种犬肾细胞系）更容易被PEDV感染，同时感染可以被抗pAPN多克隆抗体所抑制。Nam E等31人培养了能够稳定表达pAPN的ST细胞，并在之后的PEDV细胞感染实验中证明，pAPN的过表达有助于病毒在ST细胞中的复制。尽管PEDV能够在不表达pAPN的猴源细胞系Vero E6细胞上连续传代，但数据明确显示pAPN与PEDV感染之间有关联32。1.7 PEDV繁殖与装配PEDV作为

15、冠状病毒的一种，是最大的RNA病毒，其繁殖装配过程机制较为复杂，包含有多种病毒及细胞蛋白的参与。PEDV基因组的第一个开放阅读框编码一个较大的多聚蛋白，即复制酶多聚蛋白1a/1b，后期被加工成一系列直接或间接与病毒复制相关的病毒蛋白，包括RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）、RNA解旋酶、蛋白酶、金属结合蛋白和一些功能未知的蛋白。基因学水平的研究认为这其中的大部分蛋白都参与了RNA病毒的复制。除了病毒蛋白之外，很多细胞蛋白也被认定与PEDV复制顺式作用元件相互作用，如异质核糖核蛋白（hnRNP）A1、PTB、PABP和线粒体顺乌头酸酶等。与其他RNA病毒相似，PEDV能够将细胞RNA转录翻译体

16、系的细胞蛋白改变，从而被病毒复制所利用。尽管目前关于PEDV的RNA复制机制尚有争议，但学者们普遍认同：其RNA复制是由病毒RNA上的顺式作用元件指导，配合其编码的反式作用因子共同完成。事实上，连续的蛋白质合成依赖于RNA的合成，因为蛋白合成的抑制因子能够在病毒复制周期的任一阶段来抑制病毒RNA的合成33-34。参与复制的这些蛋白产物的具体精确的性质和功能删除有待于进一步发掘。PEDV的复制不仅有病毒蛋白的参与，还包含了很多细胞蛋白，这些细胞蛋白在PEDV的作用下不再行使其在宿主细胞中的正常功能，转而在病毒复制周期中扮演重要角色。在感染细胞提取物中没有能够与病毒RNA发生交联反应的病毒蛋白，这

17、说明病毒蛋白与病毒RNA之间的相互作用只是通过细胞蛋白间接发挥作用。2 假病毒2.1 假病毒的发展假病毒研究起始于逆转录病毒载体的应用，是伴随着重组病毒表达技术、哺乳动物细胞蛋白表达技术的提高而发展起来的35。从最初的重组痘病毒感染哺乳动物细胞生产系统经历重组塞姆利基森林病毒( SFV) 系统到酵母表达系统，以及最新的哺乳动物细胞转染表达系统。用哺乳动物细胞转染表达系统构建假病毒已逐渐取代传统方法成为主要通用方法。目前，研究者多采用多质粒共转染哺乳动物细胞系统进行假病毒生产，多质粒通过特定转染方法进入细胞，在胞内进行复制表达组装成含报告基因的假病毒，通过收获纯化等方法获得假病毒。2.2假病毒的

18、特点 假病毒耐核酸酶作用，稳定性好，易保存和运输。由于外源RNA包裹在假病毒的外壳蛋白内，所以可以抵抗外界核酸酶的作用，不易被降解。因此，假病毒稳定性良好，在室温条件下可以保存至少30d，4可以保存更长时间，从而解决了RNA 质控品在使用、保存和运输中稳定性的问题。 在 RNA 标本检测过程中，假病毒真正做到从样品处理到扩增的全程质量监测在核酸检测过程中，为保持与实际检测样品间扩增效率的一致性，作为标准品应尽量选择与实际检测样品结构近似的样品。例如，以基因组DNA为起始材料时就要选择基因组DNA作为标准品，进行RNA 解析时最好选择目的基因的RNA 作为标准品。传统的RNA病毒检测的质控品和标

19、准品有三种：裸露的RNA 或者原病毒颗粒、体外转录RNA以及质粒DNA，但是这些质控品都有各自的弊端。裸露的RNA容易被广泛存在的核糖核酸酶降解，提取困难且具有生物传染性。相对于传统 RNA 病毒质控品，假病毒的蛋白-RNA 复合体的结构与天然病毒相似，即都是外壳蛋白包裹核酸，因此可以把假病毒视为病毒材料对待，必须经过RNA 提取、反转录后才可用于PCR 扩增，从而对RNA 病毒的检测进行全程监控，保证试验数据的可靠性。与自然源性病毒相比,假病毒整合了其他病毒的囊膜蛋白,而且核酸分子上编码囊膜蛋白的基因被修饰掉,所以这种病毒丧失了病毒的自我复制能力,只能进行“一个细胞周期” 的侵染,从而得到的

20、病毒样颗粒无传染性，不会对实验人员造成伤害，也不会对环境造成污染。同时，假病毒通过细菌培养、表达即可获取，极为方便37。因此，在研究致病性高而不易培养、或者不易体外培养的病毒时,制备假病毒是一种安全可靠的方法。2.3假病毒分类以原核表达为基础的假病毒其技术原理：包装病毒与外源RNA病毒分别通过RT-PCR技术获得目的基因后T载体克隆鉴定，然后通过酶切连接构建既含有外源RNA 相应基因序列又含有包装病毒包膜蛋白相应基因序列的重组子。原核表达 产物进行破碎处理、核酸酶消化、纯化，获得无基因组污染的病毒样颗粒，即假病毒。目前，原核表达假病毒载体所采用的包膜蛋白主要有如下2种，MS2 噬菌体包膜蛋白和

21、烟草花叶病毒（tobacco mo- saic virus, TMV）包膜蛋白。MS2 噬菌体是单链正性RNA病毒，为26nm 长的20面体，共有3569个核苷酸，包含有3个基因，编码成 熟酶蛋白、包膜蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白4种蛋白质分子。噬菌体由180个包膜蛋白单体、一分子成熟酶蛋白和一分子基因组RNA 组成。在MS2 噬菌体包膜蛋白的研究中发现包膜蛋白与噬菌体复制酶5' 端由19 个碱基 (19 mer) 组成的茎环结构RNA序列有特异性相互作用，这种作用可引发噬菌体外壳的组装，同时又将噬 菌体基因组RNA包装到包膜内。研究人员发现在包装位点后引入非噬菌体基因序列也可以引发包装

22、。因此，如果将外源病毒 RNA的cDNA 克隆于MS2 噬菌体包膜蛋白基因序列下游，并在其下游插入终止子，转录后得到带有噬菌体操纵子RNA序列的外源病毒RNA转录本，诱导表达过程中噬菌体包膜蛋白得以表达并组装成蛋白外壳，并将携带有外源病毒RNA 序列的噬菌体基因组包裹到包膜内，构成噬菌体病毒样颗粒。烟草花叶病毒（tobacco mo- saic virus, TMV）包膜蛋白TMV 是单组分的带有帽子结构的负链 RNA 病毒，大约为6.4kb，能产生3 种亚基因组mRNA，分别编码4种蛋白：128/183K的复制酶 ，30K的运动蛋白和17.5kD的外壳蛋白，还有目前为止尚未 检测到的54kD

23、蛋白。TMV 5' 端有非翻译区 (untrans1a- tiona1 region，UTR)，可以保护TMV 基因组的RNA免受5'-3' 的外切核酸酶的降解，使之更加稳定，提高它的半衰期。运动蛋白在整个TMV 的表达蛋白中比例很小，但是，在运动蛋白内部有一段序列称之为Oa，长度为75 个核苷酸，有保守的二级结构，是TMV包装起始位点。它在体外能启动包装具有该位点的非TMV 的RNA，形成假病毒颗粒37。将外源病毒RNA序列的cDNA与TMV的包膜基因序列cDNA一起克隆连接到表达载体中，诱导表达包膜蛋白并组装成病毒样颗粒。在诱导表达过程中，外源RNA基因随同TMV本

24、身基因组一起组装到病毒颗粒内。 以真核表达为基础的假病毒。用带有一种病毒外膜蛋白基因的质粒与带有另一种病毒骨架基因的质粒共转染到包装细胞中,外膜蛋白基因在包装细胞表面表达出外膜蛋白,另一种病毒的骨架基因在包装细胞中转录翻译组装成病毒颗粒,病 毒颗粒出芽时会被细胞表面表达的外膜蛋白所包装,即形成假病毒。由于所采用糖蛋白的来源不同，目前常见的真核表达的假病毒载体主要有4种：水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-GP）假型化病毒载体；杆状病毒GP64 假型化病毒载体；淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒糖蛋白(LCMV-GP)假型 化病毒载体； 病毒糖蛋白假型化病毒载体。2.4 假病毒的应用 假病毒具有广泛的宿主范围

25、、更高的转染效率、比其原病毒更容易浓缩成高滴度，不易被血清补体灭活、非细胞周期依赖性、高效转染静止细胞等优点,假病毒模式已经被广泛应用于包括人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency Virus , HIV )在内的多种研究中。随着人们对病毒感染复制过程研究的深入,人为地加入报告基因(如荧光素酶 , Lac Z 等)改造假 病毒 ,并成功地应用假病毒系统建立了中和抗体的 检测方法。报告基因与目的基因融合后对目的基因的结构功能没有影响,为检测报告基因所引入的免疫生物发光技术(Bioluminescent immunoassay , BL I- A)不仅具有灵敏度高、特异性好、非

26、放射性、应用范围广、操作简单等优点,而且大量表达对细胞活体没有任何毒性,这为其在医学上广泛的应用开辟了道路。假病毒在病毒与宿主细胞相互关系的研究,对于有囊膜的病毒,病毒入侵宿主细胞,其侵入过程是由其囊膜蛋白决定的,因为囊膜负责识别 靶细胞表面的受体并启动吸附和穿入的过程。其侵入细胞的过程首先通过与细胞表面的特异受体 相互作用,触发细胞膜的融合或细胞膜的内吞作用 ,促使病毒入侵细胞。此外, 当两种病毒同时感染一种细胞时所发生的表型混合现象提示一种病毒的囊 膜能够包裹到另外一种不同病毒的颗粒表面。基于以上两点，在研究病毒侵入细胞的过程及其组织嗜性和受体等方面应用了此新的技术-假病毒技术。利用假病毒

27、不仅能研究病毒的细胞嗜性和进入过程 ,还可以确定病毒的易感细胞。假病毒已经成为研究病毒与宿主细胞之间相互关系的一种新型实验工具.假病毒在基因治疗领域的研究,研究表明假型逆转录病毒载体是一种新型的基因转移载体,为解决目前基因治疗中的关键问题-载体系统,提供了新的途径。以型人类免疫 缺陷病毒为基础构建的假病毒载体具有感染分裂及非分裂细胞 、使目的基因产物表达稳定 、表达时间长、载体自身免疫小、容纳外源性目的基因大等优点,尤其是假病毒载体能有效诱导免疫应答,抑制肿瘤生长, 诱导抑制免疫耐受等优点 ,是很有发展潜力的体内基因治疗新载体。同时,还能够在水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV -G )作用下,特异性

28、的识别一种在所有细胞上都存在的磷脂 ,大大地提高了其宿主范围和感染细胞的效率。因此,其在基因治疗中的重要性越来越受到人们重视38。 假病毒在DNA-病毒载体疫苗领域的研究,假病毒疫苗能引起与减毒疫苗类似的较强的保护性免疫反应,同时避免了减毒疫苗回复突变成野生株的危险。且假病毒疫苗可以克服传统疫苗灭活不完全 、免疫原不纯及过敏问题,模仿自然病毒感染时的抗原表达,表达高效、单一的蛋白抗原 ,具有特异和 高效的免疫作用,被认为最有前途的方案之一。目前,假病毒疫苗作为一种颇有前景的新方法而备受瞩目,其假病毒疫苗导入人体后,疫苗抗原可在靶细胞内以天然的方式被合成加工提成给免疫系统,从而激发机体产生对疫苗

29、基因产物特异性的CTL及抗体反应 。3 研究目的和意义自1978年在比利时首次分离得到PEDV后，从20世纪的80年代到90年代，该病在欧洲大面积爆发，包括荷兰、英国以及瑞士等。自2012年至今，PEDV在全球发生了大范围的流行，殃及亚洲包括中国、韩国和日本多个国家，甚至在美国多个州造成了大面积流行，造成了严重的经济损失。目前，对PEDV感染机制、体外培养以及防治方面颇为重视。到目前为止，对PEDV的体外培养局限于Vero E6细胞系，即非猪源细胞系，这为PEDV的进一步研究设置了很大的障碍，同时对S1蛋白的功能性研究局限于抗原表位的确定，而没有进一步研究PEDV感染细胞的机制。因此，本文针对

30、PEDV的易感细胞系进行了进一步的探索，通过尝试在猪小肠上皮细胞系繁殖PEDV，来研究PEDV感染细胞的机制，最终确定S1蛋白在介导病毒吸附于细胞表面，进入细胞起到的关键作用。本文首先制备针对PEDV的全病毒多克隆抗体，以用于检测PEDV；其次在猪小肠上皮细胞适应和繁殖PEDV，以猪源细胞进一步研究PEDV感染细胞的机制；最后尝试构建PEDV的伪型病毒，用于研究S1蛋白在被感染的猪小肠上皮细胞时，在病毒的吸附和进入过程的关键作用，为深入探索PEDV感染靶细胞机制奠定了基础。参考文献1 甘振磊, 汤德元, 李春燕, 王彬, 张晓杰, 王凤, 刘志杰. 猪流行性腹泻流行特点及流行现状的研究J. 猪

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