高效液相色谱——二极管阵列检测法测定芫花药材指纹图谱(一)

1、高效液相色谱二极管阵列检测法测定芫花药材指纹图谱(一)    作者：田元子 李娆娆 雷沛霖 黄兰岚 原思通 刘营【摘要】 目的建立芫花药材的高效液相指纹图谱分析方法。方法采用DiamondC18色谱柱（4.6 mm × 250 mm, 5 m），甲醇水梯度洗脱，体积流量为1 ml/min，柱温35 ，检测波长332 nm，记录时间50 min。以芫花素为参照物，对17批样品进行测定并计算相似度。结果初步建立芫花药材的指纹图谱，标定7个共有峰，各产地药材之间的相似性良好。结论该方法稳定可靠，简单可行，能够提高芫花药材的质量控制标准。 【关键词】

2、芫花药材 反相高效液相 指纹图谱 相似度Abstract：ObjectiveTo establish the analytical method for the fingerprint of Flos Genkwa by HPLCDAD. Methods HPLC condition: column Diamond C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 m), the mobile phase was mixtures of methanol and water in gradient elution mode, the flow was 1 ml/min, the col

3、umn temperature was 35 , the detection wavelength was set at 332 nm, and record time was 50 min. Genkwanin was used as the reference compound and 17 batches of Flos Genkwa were determined. Results7 copossessing peaks were selected as the common peaks, and the similarity of the fingerprint was close

4、in different growing region. ConclusionThis method is simple, accurate and can provide scientific reference for further quality control of Daphne genkwa Sieb. et Zucc.Key words：Flos Genkwa; HPLC-DAD; Fingerprint; Similarity芫花为瑞香科植物芫花Daphne genkwa Sieb. et Zucc.的干燥花蕾，为传统的泻下逐水药，有毒，具有泻水逐饮、解毒杀虫的功效，内服用于治

5、疗水肿胀满，胸腹积水，痰饮积聚，气逆咳喘，二便不利，外用治疗疥癣秃疮，冻疮1。现代研究表明芫花还具有治疗慢性支气管炎、肝炎、妊娠中期引产、抗白血病等作用2。芫花中的黄酮类成分（芫花素等）为其镇咳祛痰、杀虫的有效成分；二萜原酸酯类成分（芫花酯甲等）是利水、杀虫的有效成分，也是毒性成分2。两种成分含量测定方法及含量限度要求已另文发表3，4。作为多组分的中药材，仅有某个有效成分或毒性成分的定性定量研究不足以全面反映芫花药材质量。指纹图谱在控制多组分成分方面具有整体性和特征性的优点。目前尚未见到芫花药材指纹图谱研究的文献报道。因此本实验采用HPLCDAD法对其进行研究，以芫花素为参照物，测定17批样品

6、并计算相似度，标定了7个共有峰，初步确定了芫花药材的指纹图谱，以期为提高该药材的全面质量控制建立一种快速、简单、准确有效的方法。1 仪器与试药Waters 高效液相色谱仪（600 Pump; Waters 600 Controller; Waters 996 PDA Detector）Millennium32色谱管理软件（美国Waters公司）。芫花素对照品为自制，经UV，1H NMR，13C NMR鉴定结构，经HPLC检测，面积归一化法计算纯度大于98 %，符合含量测定的要求。甲醇为色谱纯，水为自制高纯水，其余试剂均为分析纯。芫花药材共17批，其中市售品15批，分别购自河北安国（3批）、安徽

7、亳州（2批）、广西（4批）、河南郑州（2批），河南登封（3批）、广州清平（1批）；采集品2批，采自河南信阳；经原思通研究员鉴定均来源于瑞香科植物芫花Daphne genkwa Sieb. et Zucc.的干燥花蕾或花。2 方法与结果2.1 色谱条件色谱柱为Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 m）。流动相为甲醇、水，两相梯度洗脱，0 min，45 甲醇；10 min，55 甲醇；20 min，65 甲醇；40 min，80甲醇；50 min，100 甲醇冲柱30 min，然后用45 甲醇平衡柱子30 min。体积流量为 1 ml/min。柱温为35 。检

8、测波长332 nm。记录50 min的色谱图。2.2 对照品溶液的制备取芫花素对照品约0.5 mg，精密称定，置25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，每毫升中含芫花素0.021 6 g/l。2.3 供试品溶液的制备 取各地样品0.5 g，精密称重，准确加入甲醇25 ml，称重，超声10 min，待其冷却至室温，称重，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液过微孔滤膜（0.45 m），即得。2.4 样品测定 精密吸取各样品的供试品溶液10 l和对照品溶液5 l，注入液相色谱仪，记录液相色谱图。2.5 方法学考察2.5.1 精密度实验取供试品溶液（第6号样品），连续进样5次，测定，计算各共有峰的相

9、对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3 ，表明仪器性能良好。2.5.2 重复性实验取第6号样品5份，制备供试品溶液，分别进样测定，计算得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3 ，表明样品的制备方法稳定。2.5.3 稳定性实验取第6号样品5份，分别在0，2，4，6，8，12 h进样，测定，计算得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3 ，表明样品溶液在12 h内稳定性较好。2.6 指纹图谱及技术参数5在上述条件下测定17批样品，选择各样品中共有的7个色谱峰作为共有峰。以芫花素色谱峰（7，S）为参照峰，其保留时间和峰面积为1，分别求出其他各组份的相对保留时间和相对峰面积，结果

10、见表12。 表1 17批芫花药材指纹图谱中共有峰的相对保留时间表2 17批芫花药材各批样品中各共有峰的相对面积2.7 相似度评价及对照指纹图谱的建立 采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2000A版）对各样品色谱图的原始数据文件（输出格式为aia）进行分析，自动匹配，并以17批样品生成的对照谱图（中位数法）作为对照模板，得到芫花对照药材的对照指纹图谱(见图1)；计算各色谱图的整体相似度均在0.9以上，见表3。3 讨论3.1 流动相的确定为获取足以代表芫花特征的指纹图谱，在选择HPLC色谱条件的过程中，曾以甲醇水系统和乙腈水系统为流动相，分别进行考察，结果显示甲醇水系统所得色谱图基线平稳，主要色

11、谱峰均基本达到基线分离，因此确定以甲醇水系统为流动相。3.2 检测波长和采集时间的选择 为了获得更多的样品信息，采用光电二极管阵列检测器（DAD）全波长扫描的方法，采集不同波长下的色谱图，以332 nm下基线平稳，且色谱峰数目较多，各峰的分离度较好，峰高合适，因此确定332 nm为检测波长。实验中记录了110 min的色谱图，发现50 min以后无色谱峰出现，故确定采集时间为50 min。表3 17批芫花药材指纹图谱相似度结果3.3 提取溶剂的选择采用多种提取溶剂，如三氯甲烷、乙醇、甲醇作为溶剂进行提取，研究中发现，而三氯甲烷和乙醇中色谱峰数目较少，且芫花素峰面积较小，说明这两种试剂对该药材中

12、成分的提取效果较差；而甲醇提取液中色谱峰较多，且分离度较好，因此选择甲醇为提取溶剂。3.4 小结本实验以HPLCDAD法测定芫花药材的指纹图谱，方法简便，可操作性强，对于提高该药材的质控标准提供了实验数据。所建立的芫花药材HPLC对照指纹图谱可以作为芫花药材真伪鉴别的参考依据。如果能够获得更多代表性的样品，按照不同产地、不同采收期分别进行测定，比较异同点；或者在样品制备过程中采用现代方法（如大孔树脂法等），获得更多成分的信息，将会获得更全面的科学依据。芫花药材主要包括黄酮类成分和二萜原酸酯类成分，两类成分极性和含量差异较为悬殊，很难在同一色谱图上显现各自的成分群。本实验方法主要对芫花药材中的黄酮类成分进行测定，对二萜原酸酯类成分群的指纹图谱研究将需做进一步的研究，使芫花药材的质量评价体系更为完善。【参考文献】1 国家药典委员会. 中国药典, 部S. 北京: 化学工业出版社, 2005: 109.2 张保献, 原思通, 张静修, 等. 芫花的现代研究