从酵母细胞中分离纯化醇脱氢酶

1、从酵母细胞中分离纯化醇脱氢酶 柳畅先，吴士筠，胡卫钊(中南民族大学化学与生命科学学院，武汉，430074) 摘要：本文报道了从酵母细胞中提取醇脱氢酶，并进一步纯化的过程。采用硫酸铵分级沉淀，SephadexG-100葡聚糖凝胶层析，DEAE-cellulose离子交换层析技术。收得率为2.5%，纯化倍数为26.2。关键词 ：醇脱氢酶；分离纯化；酵母菌 中图分类号：658 醇脱氢酶(ADH)除了在食品等工业中的作用之外，其在科学研究和分析测定中也具有重要价值，是酶法测定乙醇或乙醛含量的工具酶。沉淀法和层析法至今仍是广泛采用的分离蛋白质和酶的重要手段1。国内外在这方面的研究从20世纪70年代以来有

2、很大进展，各种类型的层析技术用于生物大分子的分离，并得到迅速发展。用离子交换层析、亲和层析等方法分离纯化ADH和其它蛋白质25，经过45个纯化步骤后，纯化倍数可达100多倍。我国在酶的分离纯化技术上，酶制品的活性程度上，与国际先进水平相比还有较大的差距。所以对于酶分离纯化技术的研究，具有重要的意义。我们从酵母细胞中分离出醇脱氢酶，并通过硫酸铵分段盐析、凝胶层析以及离子交换层析对该酶进行纯化，用较少的步骤得到了相对高的纯化倍数。 实验部分 1.1 仪器、试剂、菌种及培养基 HYA型恒温摇床；LRH-250-G型光照培养箱；GL-20B型高速冷冻离心机（中国科学院武汉科学仪器厂）；78-1型磁力加

3、热搅拌器（杭州仪表电机厂）。硫酸铵；Sephadex G-100（Promega公司）；DEAE-cellulose；牛血清白蛋白BSA（上海伯奥生物科技公司）；三羟甲基氨基甲烷Tris（北京化学试剂公司）；氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD（武汉中健科技发展有限公司）。 酵母菌；牛肉膏蛋白胨液体培养基；琼脂斜面培养基。1.2 实验方法1.2.1 菌体培养 将酵母菌种接种于斜面培养基中，37培养24h后，再将菌种接种于液体培养基中，在恒温摇床37培养10h。离心收集菌体细胞，贮存于-20备用。1.2.2 粗抽提液的制备取以上菌体细胞，加入磷酸氢二钠溶液，37左右搅拌2h，再在室温下继续搅拌3h，

4、3000r/min离心15min，保留上清液。1.2.3 酶的纯化将粗抽提液迅速加热到55，并不断搅拌，维持15min，然后迅速冷却至0，4000r/min离心5min，保留上清液。用饱和度分别为10%，20%，30%，40%，45%，50%，55%，60%，65%的硫酸铵分段盐析沉淀上清液，离心收集沉淀物，用Tris-HCl缓冲液溶解。 取45%60%饱和度的盐析沉淀，溶于50mmol/L Tris-HCl(pH8.6)缓冲液中，上Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析柱，用相同缓冲液洗脱。收集洗脱出的具有活性的酶液，上DEAE-cellulose离子交换层析柱，用浓度为0.10.4mo

5、l/L的NaCl梯形梯度溶液洗脱。1.2.4 酶活力的测定于石英比色皿中加入3mL0.05mol/L Tris-HCl缓冲液，40L 0.05mol/L NAD溶液，40L 17mol/L C2H5OH溶液后混匀，再加入一定量的酶液，快速混匀后立即在340nm处测定吸光度变化值，计算酶活力。以每分钟催化1mol底物转化为产物的酶量定义为一个酶活力单位（U）。1.2.5 蛋白质浓度的测定采用Folin-酚试剂法6，以牛血清白蛋白作标准曲线。2 结果与讨论2.1 酵母细胞的生长以及细胞破碎 将斜面培养基上的菌种接种于液体培养基中，在36振摇培养。每隔一段时间取2mL培养液，在550nm波长处测定吸

6、光度，绘制酵母细胞生长曲线。培养8h后，细胞生长达到稳定期。在离心收集的酵母细胞中加入磷酸氢二钠溶液，37左右连续搅拌提取，每隔一段时间测定提取液在280nm波长处的吸光度，绘制蛋白质溶出曲线。经过约2h后，酵母细胞基本破碎。见图1。2.2 硫酸铵盐析以不同饱和度的硫酸铵分段盐析沉淀经热处理步骤后的酶液，测定盐析上清液及沉淀的蛋白质浓度及酶活性。由图2可知，最佳盐析范围为45%60%硫酸铵饱和度。2.3 Sephadex G-100凝胶层析将硫酸铵盐析后所得的酶液上Sephadex G-100凝胶层析柱，用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，洗脱曲线见图3。活力峰在1420管之间。

7、凝胶层析同时起到了脱盐和提纯的作用。2.4 DEAE-cellulose离子交换层析收集由凝胶层析柱洗脱出的具有活性的酶液，上DEAE-cellulose离子交换层析柱，用浓度为0.10.4mol/L的NaCl梯形梯度溶液洗脱。活力峰在4055管之间。洗脱曲线见图4。 图1 酵母细胞生长曲线 图2 硫酸铵盐析曲线 及蛋白质溶出曲线1.酵母细胞生长曲线；2.蛋白质溶出曲线 1.A280；2.酶活力 Fig.1 Growth curve of yeast cell Fig.2 Ammonium sulfate salting out and resolving out curve of prote

8、in curve for ADH 1.growth curve of yeast cell； 1.A280； 2.resolving out curve of protein 2.activity of enzyme 图3 Sephadex G-100凝胶柱层析 图4 DEAE-cellulose离子交换层析 洗脱曲线 洗脱曲线1.A280；2.酶活力 1.A280；2.酶活力 Fig.3 Elution curve of ADH from Fig.4 Elution curve of ADH from sephadex G-100 column chromatography DEAE-cel

9、lulose column chromatography 1.A280；2.activity of enzyme 1.A280；2.activity of enzyme2.5 酶的分离纯化结果醇脱氢酶经菌体培养、细胞破碎及抽提、硫酸铵盐析、凝胶层析、离子交换层析分离纯化，结果见表1。 表1 酵母细胞中ADH的分离纯化结果 Table 1 Purification results of alcohol dehydrogenase from yeast cell 纯化步骤总蛋白量( mg )总活力(U)比活力(U/mg蛋白)纯化倍数收得率(%)粗抽提液 硫酸铵盐析凝胶层析离子交换层析 4375 5

10、10 154 4.2 9598 6663 3328 242.22.2 13.1 21.6 57.7 1 6.0 9.8 26.2100 69.4 34.7 2.5参考文献： 1 严希康.生化分离工程.北京：化学工业出版社，2001.236-309.2 Roy S K, Nishikawa A H.Biotechnology and Bioengineering,1979,21:775-785.3 Chase H A,Draeger N M.Separation Science and Technology,1992,27(14):2021-2039.4 Willoughby N A,Kirsc

11、hner T,Smith M P,et al.J.Chromatogr.A,1999,840:195-204.5 Hu S,Zhang Z,Cook L M,et al. J.Chromatogr.A,2000,894:291-296.6 张龙翔，张庭芳，李令媛.生化实验方法和技术(第二版).北京：高等教育出版社，1997，137-138. Separation and purification of alcohol dehydrogenase from yeast cell Liu Chang-xian,Wu Shi-jun,HU Wei-zhao (College of Chemistry

12、 and Life Science,South-Central University for Nationalities,Wuhan,430074)Abstract In this paper the procedure for the separation and purification of alcohol dehydrogenase from yeast cell was introduced.The crude extract was treated by saturated ammonium sulfate precipitation,further purified by Sephadex G-10