胃淋巴增生性疾病IgH基因重排的检测及意义

1、    胃淋巴增生性疾病IgH基因重排的 检测及意义        【摘要】目的探讨免疫球蛋白重链(IgH)基因单克隆性重排的检测对胃MALT淋巴瘤的诊断及鉴别诊断价值。方法应用半巢式聚合酶链反应(semi?nestedPCR)技术检测石蜡包埋的31例胃MALT淋巴瘤、26例淋巴细胞性胃炎及11例对照标本免疫球蛋白重链(IgH)基因重排的克隆性。引物选用互补于IgH基因V区及J区保守序列的Fr2,Fr3。结果(1)用Fr3为引物扩增，74.2的胃MALT淋巴瘤获得单

2、克隆性重排条带；联合Fr2扩增，可使其检出率提高到87.1。(2)对手术及胃镜活检的石蜡包埋标本，该技术具有相同的敏感性；(3)26.9的淋巴细胞性胃炎中出乎预料地发现有IgH基因单克隆重排条带。结论用IgH基因引物进行PCR扩增是临床上诊断和鉴别诊断胃MALT淋巴瘤的有效手段。有B细胞单克隆形成的淋巴细胞性胃炎可能系淋巴瘤的前期病变，对其进行监测和随访是十分重要的。【关键词】胃MALT淋巴瘤；聚合酶链反应；免疫球蛋白重链(IgH)基因重排 Immunoglobulin heavy chain gene rearrangement in gastric lymphoproliferative

3、disorders : assays and implicationsGAN Huatian,OUYANG Qin,LI Gandi et al（Department of internal Medicine,The First University Hospital,West China University of Medical Sciences,Chengdu,China 610041.）【 Abstract】 Objective Semi nested PCR method was attempted to detect monoclonal immunoglobulin heavy

4、chain ( IgH ) rearrangement in B cell neoplasms . Methods Paraffin embedded tissues from patients with mucosa associated lymphoid tissue ( MALT ) lymphoma ( n=31 ) , with lymphocytic gastritis ( n=26 ) and from controls ( n=11 ) were investigated using frame work ( FR ) 2 and 3 as primers. Results W

5、ith Fr3 , B cell monoclonality was positive in 74.2 ( 23/31 ) of cases with MALT lymphoma , which increased to 87.1 ( 27/31 ) with Fr3 Fr2 primers. No difference was found in sensitivity between endoscopic and surgical specimens. B cell monoclonality was unexpectedly detect in 26.3 of cases with lym

6、phocytic gastritis.Conclusion PCR amplified IgH gene method appeared effective to diagnosis or differentiate gastric MALT lymphoma and to monitor probable alterations of lymphocytic gastritis with B cell monoclonality , a possible precusor, to lymphoma .【 Key words】Gastric MALT lymphoma ; Polymerase

7、 chain reaction ; Immnoglobulin heavy chaingene rearrangement胃粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤是较常见的结外淋巴瘤。由于其在组织学上常有淋巴滤泡和浆细胞出现，而淋巴细胞性胃炎亦存在类似组织学表现，因此常规组织学方法对其诊断和鉴别诊断十分困难。免疫组化技术对其诊断起了较大的推动作用，但仍不尽人意。近来发展的聚合酶链反应(PCR)技术检测免疫球蛋白重链(lgH)基因重排为淋巴瘤的诊断和鉴别诊断提供了一种新的手段。本文采用该技术以检测胃MALT淋巴瘤以及淋巴细胞性胃炎中lgH基因重排的克隆性，旨在探讨该技术对MALT淋巴瘤的诊断和鉴别诊

8、断价值。材料与方法一、材料：收集华西医科大学第一医院病理科1986至1996年档案保存的手术及胃镜活检石蜡包埋标本68例。其中胃MALT淋巴瘤31例(胃镜活检标本13例、手术标本18例，符合Dawson诊断标准1，且免疫组化证实为MALT来源)；淋巴细胞性胃炎26例(均为胃镜活检标本，符合Dixon诊断标准2)，7例胃息肉及4例胃平滑肌瘤(均为胃镜标本)为对照。二、方法：(1)组织学及免疫组化：复习所有病理诊断，重新切片作HE染色。观察淋巴细胞浸润或淋巴滤泡形成。L26(1：100)胃MALT淋巴瘤组织学改变重新按照Isaccson等1988年关于胃肠恶性淋巴瘤的新分类方案分类3。免疫组化采用

9、的第一抗体为KiB5(1100)，L26(1100)，UCHL-1(1100)，anti-K(13000)anti-(13000)，除KiB5来自德国Kiel大学外，其余均为Dako公司产品。染色方法为LSAB法和PAP法。(2)IgH基因重排检测：(a)DNA的提取参照sukpanichnant等的方法进行4。(b)PCR扩增：引物选用互补于IgH基因V区及J区保守序列的Fr2、Fr3、LJH、VLJH作半巢式(semi-nested)PCR。引物由德国德累斯顿大学医院赠送，其序列如下：Fr2:5'-TGGAGTCCGCACAGGCCTCTCCNGG-3;Fr3:5'-ACA

10、CGGCCTGCTGTATTACTGT-3'LJH:5'-TGAGGAGACGGTGACC-3'VLJH:5-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3'。参照Diss等的方法进行5。首先用Fr3和LJH作第一次扩增，共30个循环。扩增产物以双蒸水11000稀释后取10l用Fr3和VLJH作第二次扩增，共20个循环。Fr3-PCR扩增为阴性者，用Fr2-PCR再次进行扩增。第一步用Fr2和LJH扩增；第二步用Fr2和VLJH扩增。每次扩增均设无模板DNA的阴性对照和Raji细胞株DNA(德国德累斯顿大学医院Thiede博士赠送)的阳性对照。PCR扩增产

11、物经8聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙锭染色后，紫外线下观察结果。统计学处理：2检验，P<0.05为差异显著。结果一、组织学及免疫组化结果：31例皆为B细胞胃恶性淋巴瘤，无T细胞胃恶性淋巴瘤，且均属MALT来源；有22例伴淋巴滤泡形成。26例淋巴细胞性胃炎均可见淋巴细胞浸润或淋巴滤泡形成；免疫组化染色表明它们均为多克隆性增生。二、IgH基因重排的检测结果：从表1可见，仅用一种引物Fr3扩增，31例胃MALT淋巴瘤，23例检出了单克隆性重排条带(74.2)；即在240-280bp(Fr2)或80-120bp(Fr3)处出现1条或2条狭窄而明显的特异性条带，26例淋巴细胞性胃炎，5例出现了单克隆特

12、异性条带(19.2)。但联合应用Fr2，则前者IgH基因单克隆性重排检出率可提高到87.1，后者可达26.9。4例胃MALT淋巴瘤，19例淋巴细胞性胃炎以及11例对照病例均呈现多克隆性的浅淡均匀弥漫带(smear)或无扩增产物。阴性对照未见DNA扩增产物，Raji细胞株扩增出了单克隆性重排条带。表1PCR检测lgH基因单克隆性重排结果组 别例 数Fr3()Fr23() 胃MALT淋巴瘤3123(74.2)27(87.1) 淋巴细胞性胃炎265(19.2)7(26.9) 对照组110(0)0(0)三、胃MALT淋巴瘤胃镜和手术标本PCR检测结果比较：13例胃镜标本中IgH基因单克隆性重排检出率为

13、84.8(11/13)与18例手术标本的检出率88.9(16/18)比较无差异(P>0.05)。讨论B淋巴细胞在分化早期，位于14号染色体上的免疫球蛋白重链基因的可变区(V)、多样区(D)和连接区(J)要发生随机重排。由于重排的随机性以及重排片段连结区核苷酸的随机删除或插入等使得每一克隆B淋巴细胞均有其独特的重排方式，这是人体能编码上万种不同免疫球蛋白的分子遗传学基础。这一情况见于正常淋巴组织及反应性增生。恶性淋巴瘤系单克隆性增殖疾病，所有的克隆表现为一种IgH基因重排。因此，IgH基因的重排方式可作为确定克隆性的标志6。检测IgH基因重排的经典方法是Southern杂交技术，由于该技术

14、手续繁杂，费时，有放射性污染且需新鲜组织等弊端，故很难用于临床常规检测。PCR技术的问世及发展使得临床常规检测IgH基因重排成为可能。本研究成功地使用该技术对石蜡包埋组织中提取的低分子量DNA进行了扩增，发现用Fr3为引物，其对胃MALT淋巴瘤IgH基因单克隆重排的检出率为74.2。遗憾地是Fr3为引物的PCR并不能检测出所有单克隆性IgH基因重排，许多研究表明其检测阳性率一般不超过80。因此有作者设计了针对Fr2框架区的引物Fr2作为补充，联合二组引物可使阳性率达905，本研究结果证实了这一点，我们联合Fr3和Fr2，使胃MALT淋巴瘤IgH基因单克隆性重排的检出率达87.1。此外，我们还发

15、现，该技术对手术及胃镜活检的胃MALT淋巴瘤标本IgH基因重排检出率相似，提示该技术对胃镜活检标本同样敏感。因而更具临床实用价值。胃MALT淋巴瘤是胃肠道淋巴瘤中最常见的类型。它具有独特的临床特点：生长缓慢、长期局限、预后良好。这类淋巴瘤起源于中心细胞样细胞，其组织形态特点与一般淋巴瘤不一样，常有反应性增生的淋巴滤泡存在。因此在良恶鉴别诊断上十分困难，尤其是仅根据胃镜活检的小块组织来诊断，就更易误诊或漏诊。此时，辅以IgH基因重排检测以确定其克隆性质是鉴别的关键，PCR技术在检测IgH基因重排方面不仅具有简便、快速、较敏感和特异等优点，而且适用于活检的小块组织。因此，可望成为鉴别诊断的有效手段

16、。本研究发现在组织学及免疫组化显示良性的26例淋巴细胞性胃炎中，有26.9出现了lgH基因的单克隆性重排。这一结果与Sorrentino等的报道类似7。提示某些良性淋巴增生病例中存在病理组织学及免疫组化不能检测到的单克隆性病变。尽管这些单克隆性重排并不一定就等于恶性淋巴瘤，其真实的生物学意义尚待确认7，但至少这一重排方式的出现应高度怀疑恶性疾病的可能。Sorrentino等认为这种B细胞单克隆的形成可能是癌前病变的潜在标志7。因此，对其进行监测和随访是十分重要的。PCR检测IgH基因重排在传统病理组织学和现代分子生物学之间架起了一座桥梁，该技术能在DNA水平更早更精确地反应淋巴增殖性疾病的性质

17、，因此为淋巴瘤的早期诊断，鉴别诊断及随访监测提供了特异和较为敏感的手段。然而，由于一些良性淋巴增殖疾病中也可能存在单克隆性重排，该技术本身的假阴性等问题，因此在进行基因重排分析时仍需结合病理形态观察，免疫组化染色及病人临床表现进行综合分析。以期最大限度地提高诊断的准确性。作者单位：甘华田（610041成都，华西医科大学第一医院内科）欧阳钦（610041成都，华西医科大学第一医院内科）易智慧（610041成都，华西医科大学第一医院内科）马洪升（610041成都，华西医科大学第一医院内科）李甘地（610041成都，华西医科大学第一医院病理科）杨秀英（610041成都，华西医科大学第一医院病理科）参

18、 考 文 献 1，Dawson IMP.Primary malignant lymphoid tumors of the gastrointestinal tract.Br J Surg,1961,49:80-82. 2，Dixon MF,Genta RM,Yardley JH,et al.Classification and grading of gastritis.Am J Sur Pathol,1996,20:1161-1170. 3，Isaacson PG,Spencer J,Wright DH.Classifying primary gut lymphomas.Lancet,1989,ii:1149. 4，Sukpanichnant S,Vnencakjones CL,Mc Curley TL,et al.Determination of B-cell clonality in paraffin-embedded endoscopic biopsy specimens of abnormal lymphocytic infiltrates a