酵母双杂交实验流程

1、模块七 蛋白质之间的相互作用1. 实验目的本实验以重组质粒和酵母细胞为材料, 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。 主要介 绍酵母双杂交的基本原理与操作技术; 让学生了解和掌握酵母双杂交系统的应用; 掌握酵母感受态的 制备的基本原理和主要的操作步骤。2. 实验原理1989年 Fields 和 Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识(即细胞内基因转 录的起始需要转录激活因子的参与 ,提出并建立了酵母双杂交系统。该系统作为发现和研究活细胞 体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台,近几年得到了广泛的运用和发展。相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统具有以下优点:(

2、1检测在真核活细胞内进行,在 一定程度上代表细胞内的真实情况。 (2作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作 用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 (3检测结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测 存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。 (4酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型 和分化时期材料构建 cDNA 文库,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功 能蛋白。 (5 通过 mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型、 X-Gal 及 HIS3 蛋白表 达等检测方法均很敏感。酵母双杂交系统也具有一定的局限性。 首先, 经典的双杂交系统分析蛋

3、白间的相互作用定位于细 胞核内, 因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白的研究。 酵母双杂交系统的另一个局 限性是“假阳性” 。在酵母双杂交系统建立的初期阶段,由于仅仅采用 -半乳糖苷酶这一单一的报告 基因体系,这种报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制,因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本 身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用, 使 DNA 结合结构域融合蛋白在无特异 激活结构域的情况下也可被激活转录。 另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域, 能与其 他蛋白形成稳定的复合物,从而引起报告基因的表达,产生“假阳性”结果。产生“假阴性”结果的 原因可能有许多蛋白

4、质间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、 磷酸化和二硫键形成, 还有些蛋白 的正确折叠和功能有赖于某些非酵母蛋白的辅助等。现在的酵母双杂交系统大都采用多种报告基因,如 AH109酵母株含有三类报告基因 ADE2、 HIS3、 MEL1/lacZ,这三类报告基因受控于三种完全不同、异源性的 GAL4-反应元件和三类启动子元 件 -GAL1、 GAL2以及 MEL1(如图 6-1-1 。通过这种方法就消除了两类最主要的假阳性,一类是融 合蛋白可以直接与 GAL4结合位点结合或者是在结合位点附近结合所带来的假阳性; 另一类是融合蛋 白和某种转录因子结合后再结合到特定的 TA TA 盒上所带来的假阳性

5、。 ADE2一种报告基因就已经能 够提供较强的营养选择压力,这时选择性地使用 HIS3报告基因,一来可以降低假阳性率;二来可以 控制筛选的严格性(如果需要筛选与诱饵蛋白具有较强结合的蛋白,就可以同时使用 ADE2、 HIS3两 种报告基因; 如果只需要筛选与诱饵蛋白具有中等强度或较弱结合的蛋白, 就可以使用 ADE2或 HIS3两者中的一种 。 MEL1和 lacZ 分别编码 -半乳糖苷酶和 -半乳糖苷酶,可以作用于相应的底物X-Gal 和 X-Gal 使酵母变蓝。其中, -半乳糖苷酶是外分泌酶,在酵母表面就能直接检测到; -半乳糖苷酶是内分泌酶, 需要将酵母破碎后才能检测到。 用蓝斑显示酵母

6、细胞内两个蛋白的相互作用 的方法不仅具有较高的敏感性,而且蓝斑的深浅还可以反映两个蛋白相互作用的强弱。随着酵母双杂交系统的广泛应用, 这一系统得到了不断的完善及改进, 除了经典的双杂交系统以 外,同时也衍生出单杂交系统、三杂交系统、反向酵母双杂交系统、 hSos/Ras募集系统(hSos/Ras recruitment systems 、泛素分裂系统(Split-ubiquitin systems 、双诱饵系统(Dual-bait systems等一 系列相关系统,根据这些系统的不同特点,可以分别应用于蛋白质与 DNA 、 RNA 的相互作用、蛋白 质复合体之间的相互作用、 膜蛋白质之间的相互

7、作用、 筛选阻断蛋白间相互作用的药物等一系列领域, 对经典的酵母双杂交系统起到了很好的补充,并有力地推动了酵母双杂交系统的发展与应用。酵母双杂交系统的原理是利用转录激活因子在结构上是组件式的, 即这些因子往往由两个或两个 以上相互独立的结构域构成,其中有 DNA 结合结构域(DNA binding domain, DB 和转录激活结构 域(activation domain, AD ,它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的 DB 虽然能和启动子结 合,但是不能激活转录。而不同转录激活因子的 DB 和 AD 形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录 的功能。根据转录因子的这一特性,将 BD 与已

8、知的诱饵蛋白质 X 融合,构建出 BD-X 质粒载体; 将 AD 基因与 cDNA 文库,基因片段或基因突变体(以 Y 表 融合,构建 AD-Y 质粒载体。两个 穿梭质粒载体共转化至酵母体内表达。 蛋白质 X 和 Y 的相互作用导致了 BD 与 AD 在空间上的接近, 从而激活 UAS 下游启动子调节的酵母菌株特定报告基因(如 LacZ , HIS 3, LEU 2等 的表达(图 6-1-2 ,使转化体由于 HIS3或 LEU2表达,而可在特定的缺陷培养基上生长,同时因 LacZ 表达而 在 X-Gal 存在下显蓝色。 酵母双杂交原理示意图3. 实验仪器微量取液器(2 L; 20 L; 200

9、 L; 1,000 L 、低温离心机、台式离心机、琼脂糖凝胶电泳系 统、蛋白凝胶电泳系统、凝胶成像系统、半干转移系统、恒温摇床、恒温孵箱、通风橱、制冰机、振 荡器、恒温金属浴、无菌接种环、 10 cm培养皿、 15 cm培养皿。4. 实验试剂(1裂解缓冲液(Cracking buffer :尿素 8 mol/LSDS 5 %Tris-HCl (pH 6.8 40 mmol/LEDTA 0.1 mmol/L溴酚蓝 0.4 mg/ml(2 各种基础培养基和营养缺陷培养基:minimal SD base, minimal SD agar base, YPD medium, YPD agar medi

10、um, -Leu DO supplement, -Trp DO supplement, -Leu/-Trp DO supplement, -Leu/-Trp/-His DO supplement, -Leu/-Trp/-His/-Ade DO supplement, 腺苷酸 (adenine , PEG8000, Carring DNA, 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO , TE/LiAC buffur, PEG/LiAC, X-gal 或 X-gal 。(3酵母质粒提取试剂盒, LB 培养基,羧苄青霉素和卡那霉素。(4蛋白标准。(5 Z-buffer (pH7.

11、0 :Na2HPO47H2O 16.1 g/LNaH2PO4H2O 5.5 g/LKCI 0.75 g/LMgSO47H2O 0.246 g/L(6 Z-buffer/X-Gal 液体:Z-buffer 100 ml-巯基乙醇 0.27 mlX-Gal 储存液 1.67 ml5. 实验方法酵母的复苏与表型验证:(1复苏前 12 天,配制 YPDA 琼脂并于高压消毒后倒板。(2用无菌接菌环在酵母冻存管中挑取一小团酵母细胞,接种到 YPDA 琼脂板上。(3 30 倒置孵育 35天。(4待酵母长到直径 23 mm后,将其接种到不同营养缺陷型培养基上进行表型验证。质粒转化酵母细胞(常规转化 :(1挑取

12、一直径约 23 mm的酵母克隆接种到 0.5 ml YPDA培养基中。(2剧烈震荡使细胞凝块均匀分散。(3将细胞转移到含有新鲜 YPDA 培养基的锥形瓶中。(4 30, 250 rpm,振荡孵育 1618 hr,直到稳定期(OD 600>1.5 。(5将过夜培养物转移到含有新鲜 YPDA 培养基的椎形瓶中,进一步扩增酵母细胞。(6 30 , 230270 rpm,振荡孵育使 OD 600达到 0.5 ± 0.1(一般需要 3 hr(7将细胞转移到数个 50 mL离心管中,转速 1 000 g,室温离心 5 min。(8弃去上清,加入 2550 mL消毒 H 2O ,振荡重悬、清

13、洗并收集细胞。(9转速 1 000 g,室温离心 5 min,弃上清(10加入 1 mL新鲜配置的无菌的 1 TE / LiAC重悬细胞。(11准备 1.5 mL无菌 EP 管,在每个管中加入需要转染的质粒以及担体(carrier DNA 。(12加入经 1 TE/LiAC重悬的感受态细胞,轻柔混匀。 (13每个管中加入适量体积的 1PEG/LiAC,高速震荡混匀。(14 30 , 200 rpm,振荡孵育 0.5 hr。(15加入适量体积的 DMSO ,温和颠倒混匀,不要振荡。(16 42 水浴热休克 15 min,对于大量转化,应经常摇动以混匀。(17置于冰上 510 min,室温 12,

14、000 g离心细胞 5 sec。(18移去上清,根据铺的板数加入适量体积的 1TE 重悬细胞。(19铺板,倒置平板于 30 孵育直到克隆出现。 检测目的蛋白在酵母细胞中的表达:(1挑取一直径约 2 mm、含有目的蛋白基因片段的 BD/X新鲜酵母克隆于 5 mL 相应营养缺陷液体培养基中, 30 、 230 rpm振荡孵育 16 hr。(2 将过夜培养物在 50 mL YPDA培养基中扩大培养, 30 , 220250 rpm, 使 OD 600值达到 0.40.6。(3 1,000 g离心 5 min,弃上清。(4加入 30 mL H2O ,重悬细胞。 1,000 g,离心 5 min,弃上清

15、,加入液氮速冻沉淀。(5待液氮挥发完全以后,按照 100 L/7.5 OD600的比例加入 cracking buffer重悬细胞并移入到一个小量转化 大量转化 质粒 DNA0.1 g 20200 g carrierDNA 0.1 mg 2 mg 质粒*7 每管中加入感受态细胞的 体积根据酵母细胞的数量以 及铺板的大小而定, 通常小量 转化每管加入 100 L 的感受 态细胞; 大量转化每管加入 1 mL 的感受态细胞。 如果长出来以后克隆太密则可适量减 少每管中加入的感受态细胞 的体积; 反之则可适当增加感 受态细胞的体积。转化酵母菌结果1.5 mL的 EP 管。(6按 80 L/7.5 O

16、D600的比例向 EP 管中加入酸性玻璃微珠(glass beads 。 70 加热 10 min。剧烈震荡 1 min。(7 12,000 g, 4 离心 5 min。将上清转移到一个新的 1.5 mL EP管中,置于冰上。(8 100 水浴中 35 min,剧烈震荡 1 min。(9 12,000 g, 4 离心 5 min。将两次上清合到一个 EP 管中。(10取 20 L 上清,加入上样缓冲液, 100 变性 5 min。(11 SDS-PAGE 电泳后,采用 Western blot技术检测目的蛋白在酵母细胞中的表达情况。 小规模酵母杂合(mating :(1在无菌的 1.5 mL

17、EP管,加入 0.5 mL 2 YPDA 培养基。(2挑取直径约 23 mm 、新鲜的含有表达质粒 pGBKT7-X 的 AH109酵母克隆和含有表达质粒pGADT7-Y 的 Y187酵母克隆于上述 EP 管中。(3剧烈震荡 1 min,使酵母细胞完全悬浮。(4 30 , 200 rpm振摇孵育 2024 hr。(5 将杂交混合液按 1:100稀释到 0.5YPDA 培养基中, 取 100 mL铺到 SD/-Trp/-Leu/X-Gal 板上。(6倒置平板于 30 孵育直到克隆出现。 滤纸转移法检测 -半乳糖苷酶的分泌:(1待酵母长到直径 1.53 mm大小时,取无菌、大小合适的 Whatma

18、n 滤纸贴在酵母板上。(2待滤纸被琼脂板上的水分基本浸湿后,揭下滤纸,这时酵母克隆被转移到了滤纸上。(3将附着有酵母克隆的滤纸在液氮中速冻 10 sec以上。(4将新配制 Z-buffer/X-Gal 液体滴在另一无菌的 Whatman 滤纸上,并完全浸湿滤纸。 酵母杂交操作步骤流程图Y187 Mating SD/-His/-Leu/X-Gal-Gal SD/-Ade/-Leu/-Trp/ X-Gal AH109（5）将附着有酵母克隆的滤纸小心地贴放在浸有 Z-buffer/X-b-Gal 的滤纸上。 （6）室温孵育 816 hr 等待蓝斑出现。 滤纸转移法检测 b-半乳糖苷酶的表达量 诱饵蛋

19、白的文库筛选： Y187 BD-bait AH109 AD-library Pick out positive clone Mating Extracting plasmids TDO/x-a-Gal DDO/X-a-Gal QDO/X-a-Gal Thransform DH5 LB/Kan+ Extracting plasmids Retransform into AH109 SD/-Leu Mating with BD/Vector Mating with BD/bait Mating with BD/lam DDO plate DDO plate DDO plate QDO/X-a-Ga

20、l plate QDO/X-a-Gal plate QDO/X-a-Gal plate 酵母双杂交文库筛选操作流程图 （1） 挑取一新鲜、 直径为 23 mm 的 BD-bait 酵母 AH109 于 50 ml SD/-Trp 液体培养基， ， 30 250270 rpm，1618 hr，培养至 OD600 值>0.8。 （2）1,000 ´ g 离心 5 min，弃上清。用剩余的 5 mL 左右残液重悬细胞。 （3）室温水浴融化冻存的文库（约 1 mL） ，轻柔震荡，留取 10 mL 文库用于文库滴度测定（文库滴 度测定方法见后） 。 （4） 快速将步骤 2 和步骤 3 的

21、两种液体混合到 2 L 的烧瓶中并加入 45 mL 2 YPD/Kan Kan50 mg/mL） （ 轻柔震荡；用 1 mL 2´YPD/Kan 冲洗装文库的离心管两次，并将冲洗液加入到烧瓶中。 （5）30 过夜孵育（2024 hr）并轻柔震荡（3050 rpm） 。 （6）将杂交混合液转移到一无菌离心瓶中，1,000 ´ g 离心 10 min，弃上清。再用 50 mL 2×YPD/Kan 冲洗杂交瓶两次，将两次冲洗液混合在一起重悬细胞。 （7）1,000 ´ g 离心 1 0 min，弃上清。用 10 mL 的 0.5´YPD/Kan 重悬

22、细胞，并估算重悬后的总体积， 铺板。 （8）倒置平板于 30 孵育 821 天直到克隆出现。 （9）挑取阳性克隆于 300 mL YPDA 和 150 mL 消毒甘油的混合液中，冻存于-80 。 阳性克隆验证： （1）用接种环挑取单个阳性克隆接种到新的 SD/-Trp/-Leu/-His/ X-Gal 平板上，30 倒置平板孵育。 （2）待阳性克隆长出后，再用接种环挑取单个阳性克隆，接种到新的 SD /-Trp/-Leu/-His/X-Gal 平板 或 SD/-Trp/-Leu/-Ade/ -His/X-Gal 平板上，倒置平板于 30 孵育。 （3）挑取单个阳性克隆于 5 mL YPDA/K

23、an 培养基中 30 ，250270 rpm 振摇 1216 hr。 （4）使用酵母质粒微量抽提试剂盒提取质粒。 （5）将提取到的质粒混合物（BD/bait、AD/cDNA）采用经典转化法转化 DH5a 大肠杆菌，铺 LB 抗 生素平板。LB 平板中的抗生素与 AD/cDNA 载体所带的抗性一致，这样最终得到的克隆只含有 AD/cDNA。 （6）挑取单个阳性克隆于 5 mL LB 培养基（含相应抗生素）中 37 ，250270 rpm 振摇 1216 hr。 （7）提取质粒，做 PCR 鉴定。 （8）将 pGADT7-cDNA 表达质粒转入 AH109 酵母株中将 pGBKT7-bait 表达

24、质粒转入 Y187 酵母中， 待克隆长出对带有 AD-文库蛋白的 AH109 酵母克隆进行自激活验证， 另外再将带有 AD-文库蛋 白的 AH109 酵母克隆与带有 BD-bait 蛋白的 Y187 酵母克隆进行杂交，验证阳性克隆的真实性。 2 000bp 500bp 2 000bp 500bp 2 000bp 2 000bp 500bp 500bp 文库 cDNA 片段的 PCR 鉴定 文库滴度的测定： （1）将预留的 10 mL 文库与 10 mL LB 混合均匀。 （2）取 1 mL 混合液到 1 mL LB 培养基中，混合均匀，制成稀释溶液 A（1:103） 。 （3）再从溶液 A 中

25、取 1 mL 到 1 mL LB 培养基中，混合均匀，制成稀释溶液 B（1:106） 。 （4）从溶液 A 中取 1 mL 到 50 mL LB 培养基中，混合均匀，铺板。 （5）从溶液 B 中分别取 50 mL 和 100 mL 铺板。 （6）将板倒置 3031 ，孵育 3648 hr。 （7）克隆计数并计算文库滴度（cfu/mL） ，计算文库滴度的方法如下： A：克隆数 ´ 103´ 103 ´ 2 = cfu/mL B： （克隆数/铺板体积）´ 103´ 103 ´ 103 ´ 2 = cfu/mL 6. 注意事项 （1）酵母双杂交对照的设定 常规的酵母双杂交操作时一般会设定阳性对照、阴性对照以及显色系统对照三种对照，以 MATCHMAKER GAL4 酵母双杂交筛选系统为例： 阳性对照：pGADT7-T + pGBKT7-53，其中 T 蛋白和 53 蛋白是已经明确在酵母细胞内能够发生 结合并启动报告基因表达的两种蛋白。 阴性对照：pGADT7-T + pGBKT7-lam，其中已经明确 T 蛋白和 lam 蛋白在酵母细胞内不能发生 结合。 系统显色对照，pGADT7-Pcl1，该表达质粒转入酵母细胞就能引起 b-半乳糖苷酶和 a-半乳糖苷 酶的分泌，从而检测显色系统是否有问题。 （2）假阳性现象 多种