超氧化物歧化酶修饰产物结构和性能研究_图文

1、第37卷第2期2010年北京化工大学学报(自然科学版Journa l of Be iji ng Un i ve rsity of Che m i ca l Technol ogy (Na t ura l Sc i enceVo.l 37,No .22010超氧化物歧化酶修饰产物结构和性能研究韩薇妍1龚 平1*田平芳2(11北京联合大学生物化学工程学院,北京 100023;21北京化工大学生命科学与技术学院,北京 100029摘 要:以B 2环糊精的链状衍生物和环状衍生物分别修饰超氧化物歧化酶(SOD,生成S OD 的两种修饰产物。采用化学分析方法测定衍生物的醛基、修饰产物的自由氨基以及SOD

2、的活性,并利用红外光谱表征衍生物和修饰产物的结构。对修饰产物的性能研究发现,超氧化物歧化酶经B 2环糊精环状衍生物修饰后耐酸性提高了316倍,热稳定性也有所提高,而链状衍生物修饰的SOD 热稳定性降低了37%。红外光谱分析显示,两种修饰产物的红外谱图中均带有相应的环糊精衍生物的特征吸收带,表明B 2环糊精对SOD 的修饰是成功的。关键词:超氧化物歧化酶;B 2环糊精衍生物;修饰;红外光谱中图分类号:Q81419收稿日期:2009-09-18引 言超氧化物歧化酶(SOD 可以清除体内的超氧阴离子自由基,在抗炎防辐射及延缓衰老等方面有广泛的应用。但作为酶制剂,S OD 的应用受到限制,如在机体内易

3、降解、生物半衰期短、常温易失活等。酶分子修饰是提高酶稳定性的主要方法,据报道,聚乙二醇1、脂肪酸2、低分子肝素3、右旋糖酐4等作为修饰剂都曾用于S OD 的化学修饰。文献中主要采用动物学实验研究SOD 修饰产物的半衰期、免疫原性、药代动力学等参数,验证修饰产物的临床性质。本文采用化学滴定法测定反应前后B 2环糊精醛基含量,FT I R 法探讨了修饰前后S OD 结构变化,并结合酶在不同pH 值下的活性和对温度的耐受性讨论S OD 修饰产物的性质。在酶修饰研究上,采用红外光谱表征修饰产物的结构还没有文献报道。1 实验部分111 材料与仪器超氧化物歧化酶(S OD,北京科萌普瑞生物有限责任公司;邻

4、2碘酰基苯甲酸(I BX ,百灵威化学试剂公司;B 2环糊精(B 2CD 、高碘酸钠,分析纯,国药集团北京化学试剂公司。其他试剂为分析纯。透析袋,Solar b i o 公司;UV 21700紫外可见分光光度计,北京超越未来发展有限公司;WQF 2410型付立叶变换红外光谱仪,北京瑞利分析仪器公司。112 B 2环糊精的活化B 2环糊精的链状衍生物的生成。称取适量B 2环糊精溶解于100mL 蒸馏水中,在10e 的条件下逐滴加入25mL 12%的高碘酸钠溶液,避光条件下继续搅拌20m i n ,放置暗处5e 保存过夜。次日用5%的亚硫酸氢钠溶液滴定未反应的高碘酸钠。然后用处理好的717树脂搅拌

5、吸附30m in ,再用732树脂吸附30m i n 分别除去溶液中的杂质阴离子和阳离子。溶液冷冻干燥得到B 2环糊精链状衍生物。B 2环糊精的环状衍生物的生成。将015g 干燥后的B 2环糊精和0116g 邻2碘酰基苯甲酸加入到盛有4mL 二甲基亚砜的锥形瓶中,待完全溶解后置入恒温水浴振荡仪中振荡24h ,温度控制在25e 。将得到的淡黄色透明溶液滤去不溶物,在滤液中加入125mL 丙酮,搅拌12h ,过滤,滤液经冻干后得到白色粉末,即为产物。113 SOD 的修饰反应称取014g B 2环糊精醛基衍生物冻干粉,用p H 为910碳酸氢钠缓冲溶液溶解,在4e 的低温条件下缓慢搅拌,反应8h

6、后加入715%的甘氨酸溶液终止反应。最后,加入015%NaB H 4,反应4h 后,充分透析除去小分子物质,收集透析液冷冻干燥即得SOD 的修饰产物B 2CD 2S OD 。114 分析测试采用容量滴定法分析B 2环糊精衍生物醛基含量5。S OD 自由氨基的测定采用2,4,62三硝基苯磺酸比色法分析6。B 2环糊精衍生物和S OD 修饰产物的结构采用红外光谱分析7。S OD 活力测定采用邻苯三酚终止剂法8。2 结果与讨论211 B 2环糊精修饰S OD 机理B 2环糊精是由7个葡萄糖分子以A 21,4糖苷键连接成的环状低聚糖,它具有独特的外部亲水、内部疏水的分子结构。图1是B 2环糊精衍生物修

7、饰超 氧化物歧化酶的反应示意图。图1 B 2环糊精衍生物修饰超氧化物歧化酶的反应示意图F ig .1 Mod ifi catio n of supero xide d i s mu tase by derivati ves of B 2cyclodextrin高碘酸钠是邻位二醇经典的氧化剂。它以开链方式将B 2环糊精C2、C3位的仲羟基选择性氧化成醛基(图1反应式a,生成B 2环糊精醛链状衍生物。邻2碘酰基苯甲酸是多糖中C6伯羟基专属选择性氧化剂,选择性地氧化B 2环糊精中葡萄糖单元的C6位伯羟基,在保持B 2环糊精环状结构不变的前提下,生成6位B 2环糊精单醛类环状衍生物(图1反应式b。两种

8、B 2环糊精醛衍生物,在适当条件下与SOD 分子中氨基发生Sch iff 结合反应,产物经N a B H 4还原得到S OD 的B 2环糊精修饰产物。212 B 2环糊精活化产物分析21211 醛基分析采用容量滴定法测定两种衍生物的醛基。滴定结果显示Na I O 42B 2CD 以及I B X 2B 2CD 二者的总醛量(以乙醛计,g /100mL分别为01726、11245。邻2碘酰基苯甲酸的氧化产物中醛基量明显高于高碘酸钠的氧化产物的醛基。考虑到N aI O 4氧化产物理论上是两个醛基,而邻2碘酰基苯甲酸氧化产物是6位单醛,邻2碘酰基苯甲酸的氧化效率更是远高于N aI O 4。这可能是因为

9、邻2碘酰基苯甲酸是较高碘酸钠更为温和的氧化剂,而高碘酸钠使B 2环糊精的醛基可能进一步发生反应生成羧基,及相应衍生物。N aI O 42B 2CD 的颜色与B 2环糊精以及I BX 2B 2CD 完全不同,前者颜色偏黄,而后二者为纯白色。21212 红外分析I BX 2B 2CD 、NaI O 42B 2CD 、B 2CD 红外光谱图如图2所示。对比图2谱线a 与c 可见,二者红外吸收在a IB X 2B 2C D;b NaI O 42B 2C D;c S OD图2 B 2环糊精衍生物的红外光谱图F i g .2 FT 2IR spectra of t he B 2cyclo dextri n

10、 derivati ves指纹区表现出高度一致,差别主要体现在醛基吸收带上,这表明B 2环糊精的主要结构得以保持。图2谱线c 中的1650c m -1吸收一般被归属于多糖或寡糖的末端醛基的典型吸收。由于在分子链端,受分子内和分子间氢键影响较大,吸收位置下降。在图2谱线a 中,除了原1650c m-1吸收外,又在1702c m -1出现了新的吸收带。这是I BX 2B 2CD 羰基伸缩#118#北京化工大学学报(自然科学版 2010年振动。图2谱线a 与c 表明氧化产物中新醛基的形成,以及氧化产物中B 2环糊精空腔结构的完整性。图2谱线b 是N aI O 4氧化B 2环糊精产物红外光谱。通过与图

11、2谱线a 、c 的对比可见,由于N aI O 4开环氧化破坏了环结构,所以指纹区也不同于B 2环糊精;此外,它在羰基吸收区域显示1730和1630c m -1两个较强的吸收带,前者为酯羰基,后者为醛羰基。这也证实了对醛基的容量分析结论。213 S OD 修饰产物的红外光谱分析SOD 、N aI O 42B 2CD 2S OD 、I BX 2B 2CD 2S OD 红外光谱图如图3所示。对比图3谱线a 、b 、c 可见,S OD 与N aI O 42B 2CD 2S OD 、I BX 2B 2CD 2S OD 的红外吸收,在官能团区17001550c m -1以下和指纹1100650c m -1

12、处都出现了较大的变化。这种变化是由于N aI O 42B 2CD 、I BX 2B 2CD 修饰反应后导入S OD 分子所引起的。对比I BX 2B 2CD 红外光谱和I BX 2B 2CD 2SOD 红外光谱,在指纹区所包含的主要吸收中(1157、1082、1030、945、858、756c m-1,二者显示出完全相同的吸收带,可推测修饰分子I BX 2B 2CD 完整导入了酶分子。NaI O 42B 2CD 和NaI O 42B 2CD 2S OD的情况类似, 指纹区结构也得到了证实。a S OD;b NaI O 42B 2C D 2S OD ;c I BX 2B 2C D 2S OD图3

13、 SOD 修饰产物的红外光谱图F ig .3 FT 2I R spec tra of mod ified superoxi dedis m utase sa m ples214 S OD 修饰产物性能分析21411 p H 值对酶活力影响在p H 为21210157的梯度缓冲溶液中测定SOD 和修饰后S OD 的活性。图4显示了S OD 修饰前后活力随p H 变化曲线。由4可以看出,在p H 为2128的范围内,I BX 2B 2CD 2SOD 和未经修饰S OD 在319nm 处的吸光度图4 p H 对酶活力的影响F i g .4Infl uence of p H on enzy m e a

14、cti vity变化比较平缓,同时I B X 2B 2CD 2S OD 较未经修饰S OD 在319nm 处的吸光度小。数据显示,在这个p H 范围内,I BX 2B 2CD 2S OD 活力提高了316倍(SOD 的活性与吸光度呈负相关8。在p H =3附近,NaI O 42B 2CD 2S OD 吸光值出现了峰值,随着酸度的降低吸光值呈现明显的下降趋势。在p H =912的范围内,3条曲线都呈现了快速上升趋势,此时发生了蛋白质的变性。21412 温度对酶活力影响将一定量的S OD 溶液(1mg/mL在70e 水浴锅中保温30m i n ,间隔5m in 测定S OD 和修饰后S OD 的活

15、性。图5显示了3种酶的活性随时间的变化曲线。I BX 2B 2CD 2S OD 与SOD 的热稳定性高于NaI O 42B 2CD 2S OD ,而I B X 2B 2CD 2S OD 的耐热性强于S OD 。加热35m i n 后,3种酶的活性基本没有变化,加热时间延长,NaI O 42B 2CD 2S OD 的活力逐渐降低约37%。加热50m i n ,I BX 2B 2CD 2S OD 与S OD 活力变化不显著,继续加热,活力显著下降。图5 温度对酶活力的影响F i g .5Infl uence of te m pe rature o n enzy m e activi ty21413

16、 S OD 修饰产物性能差异分析I BX 2B 2CD 2S OD 的耐酸性和耐热性均强未修饰的S OD ,NaI O 42B 2CD 2S OD 的稳定性较S OD 有所下#119#第2期 韩薇妍等:超氧化物歧化酶修饰产物结构和性能研究降。I BX 2B 2CD 2S OD 保留了B 2环糊精环状结构。一方面,保护了酶分子周围微环境,减少酶分子之间的碰撞次数,从而增加了酶的稳定性;另一方面,B 2环糊精独特的亲水结构提高了I BX 2B 2CD 2S OD 的亲水性,从而提高了I B X 2B 2CD 2S OD 的稳定性。而N aI O 42B 2CD 2S OD 破坏了B 2环糊精的环状

17、结构。3 结论用B 2环糊精修饰S OD 得到了两种修饰产物I B X 2B 2CD 2S OD 和N aI O 42B 2CD 2S OD 。前者耐酸性提高了316倍,热稳定性也有所提高,而后者热稳定性降低了37%。参考文献:1 Bull ock J ,Cho wdhury S ,Seyerdia A ,e t a.l Co mpar i sonof results of vario us m ethods used to de ter m i ne the extentofm odificati on ofm ethoxy pol yet hylene glycol 50002M odi

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