射线内照射对人增生前列腺细胞凋亡的影响

1、射线内照射对人增生前列腺细胞凋亡的影响    【摘要】     目的 探讨射线内照射对人增生前列腺细胞凋亡的影响。方法 20例前列腺增生(BPH)患者随机分为4组：对照组未行内照射，3组照射组于前列腺切除术前1，4，7 d行90Sr/90Y射线内照射，采用TUNEL染色、流式细胞术和琼脂糖凝胶电泳检测前列腺细胞凋亡变化。结果 与对照组比较，射线内照射后前列腺细胞凋亡增多，并随时间延长而增加（P0.01），对照组基因组DNA保持完整，射线辐射7 d后基因组DNA呈现梯状带凋亡改变。结论 射线内照射能够有效诱

2、发人增生的前列腺细胞凋亡，进而引起前列腺组织萎缩。     【关键词】  前列腺增生；电离辐射；细胞凋亡    Effect of irradiation on cell apoptosis in human hyperplastic prostatic tissues    GU XinQuan, CAO Xia, KONG XiangBo, et al.    Department of Urology, ChinaJapan Union H

3、ospital of Jilin University, Changchun 130031, Jilin, China    【Abstract】  Objective  To investigate the effect of irradiation on cell apoptosis in human hyperplastic prostatic tissues. Methods  20 patients with benign prostatic hyperplasia (BPH) were divided into 4 gro

4、ups according to the different time treated with 90Sr/90Y irradiation  to prostatic hyperplasia applicator before prostatectomy or TURP. The cell apoptosis of human hyperplastic prostatic tissues was detected by TUNEL and flow cytometry and agarose gel electrophoresis.Results  Compared wit

5、h control group, the percentage of cell apoptosis arose after treated with 90Sr/90Y irradiation and grew more with time going (P0.01). DNA kept complete in control group while typical DNA ladder band appeared in DNA fragment electrophoresis and the positive cells that presented browed were observed

6、in irradiation 7 group. Conclusions  rays irradiation can efficiently induce cell apoptosis from human prostatic hyperplasia tissue and cause the atrophy of prostatic tissue.    【Key words】  Benign prostatic hyperplasia；Radiation；Apoptosis     细胞凋亡在前列腺增生（

7、BPH）的发生、发展中具有关键性作用1，2。电离辐射作为一种基因毒素，除了可使前列腺组织中与细胞凋亡相关的基因和细胞因子发生改变外，还能直接或间接引起DNA损伤而诱发凋亡3，4。本实验采用TUNEL染色、流式细胞术（FCM）和琼脂糖凝胶电泳检测射线内照射对增生前列腺细胞凋亡的影响，为采用电离辐射治疗BPH提供实验依据。    1  材料与方法    1.1  实验分组  BPH患者20例，年龄5872岁，病程213年，患者随机分为4组，每组5例：3个照射组于前列腺切除术前1，4，7 d行90Sr/90Y射

8、线内照射，照射剂量为3050 Gy，对照组未行内照射。各组均行经尿道前列腺切除术或经膀胱前列腺摘除术获得前列腺标本。    1.2  TUNEL染色检测细胞凋亡  4%多聚甲醛固定前列腺组织46 h，石蜡包埋。切片加蛋白酶K 37消化5 min，TBS洗涤。加含有TdT和DIGdUTP的标记液20 l/片，37标记2 h，TBS洗涤2 min×3次。加封闭液50 l/片室温30 min，加封闭液1100稀释生物素化抗地高辛抗体50 l/片，37反应30 min，TBS洗涤。加SABC 37反应60 min，TBS洗涤。DAB显色15

9、min，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。显微镜下凋亡阳性细胞核呈深浅不一的棕黄色，正常细胞核呈蓝色，在每张切片上随机选取10个高倍镜视野，计阳性细胞数和细胞总数，计算阳性反应细胞数占细胞总数的平均百分比。    1.3  FCM检测凋亡细胞DNA含量  新鲜组织研磨成单细胞，70%冷乙醇固定，4过夜。600 r/min离心5 min，弃上清，加0.01 mol/L PBS 5 ml，混匀1 500 r/min离心，弃上清，反复3次。用PBS调整细胞浓度106/ml，过350目滤网，制成单细胞悬液，加入浓度200 g/ml的RNase A，37

10、水浴30 min，加入低渗荧光染料溶液混匀，4避光染色30 min。用流式细胞仪摄取PI荧光，测凋亡细胞核百分率。    1.4  DNA琼脂糖凝胶电泳  组织研碎后，离心去上清，加入10倍体积的DNA抽提液混匀，37水浴1 h，加入蛋白酶K，50水浴3 h，12 000 r/min离心5 min，用饱和苯酚抽提上清1次，再用苯酚/氯仿/异丙醇（25241）1ml充分混匀，8 500 r/min离心5 min，弃酚相，保留上清，上清中加入3 mol/L醋酸钠和冷乙醇，-20沉淀过夜。-10 12 000 r/min离心10 min，将沉淀溶于2

11、0 l  TE缓冲液，加入1 l RNA酶，37保温1 h。加4 l样本缓冲液到含有0.4 g/ml溴化乙锭的1%2%的琼脂糖凝胶的样品孔中，室温、恒流75 mA，于1×TAE缓冲液中电泳12 h，紫外灯下观察实验结果。    1.5  统计学处理  数据应用SPSS11.5统计软件进行统计学处理，组间比较采用t检验。    2  结  果    2.1  TUNEL法染色检测前列腺细胞凋亡  对照组仅见少数散在的凋亡细胞，经

12、90Sr/90Y射线辐射后细胞凋亡增多，并随时间而逐渐增加。与间质细胞比较，腺上皮细胞凋亡更加明显，见图1。    2.2  FCM检测凋亡细胞DNA含量  经流式细胞仪分析凋亡细胞的DNA含量，可见对照组凋亡细胞百分率为（1.74±0.35）%，射线辐射可使前列腺组织细胞周期时相发生改变，在二倍体峰前出现亚二倍体峰即凋亡峰。随时间延长凋亡细胞逐渐增多，辐射1、4、7 d凋亡细胞百分率分别为(3.83±0.74)%，(5.66±1.72)%，(13.15±3.03)%，与对照组比较差异显著（P0.01）。

13、    2.3  DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡  对照组基因组DNA保持完整，经射线辐射7 d后基因组DNA发生断裂，呈现典型的凋亡改变即DNA梯形带（DNA Ladder），表明射线可使细胞核内DNA在核小体连接处发生断裂，形成180200 bp及其整数倍的核苷酸片段，见图2。    图1  TUNEL染色检测前列腺组织中细胞凋亡(×400)    图2  DNA琼脂糖凝胶电泳    3  讨  论&

14、#160;   细胞凋亡涉及一系列基因表达、蛋白质和酶的激活，是细胞为了适应生存环境而主动采取的死亡方式，良性增生的前列腺组织中很少见到细胞的有丝分裂，DNA的合成也少于正常细胞，提示BPH的病因可能不是前列腺细胞的过度增殖引起，而是细胞凋亡减少所致5。细胞凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活，细胞染色体DNA被切割，出现单链或双链缺口，并产生与DNA断点数目相同的3OH末端。末端脱氧核糖核酸转移酶可将地高辛标记的dUTP(DIGdUTP)标记至3OH末端，DIGdUTP结合在DNA断点部位，可以通过碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体反应后，加入显色底物予以显示。此种方法灵敏度很高

15、，在凋亡早期就可以检测到DNA断裂。    在本实验中，通过原位末端脱氧核糖核酸转移酶将地高辛标记的dUTP(DIGdUTP)标记至DNA断点部位，以显示细胞凋亡的程度，阳性细胞核呈棕黄色。实验结果可见对照组仅见极少数散在的凋亡细胞，经90Sr/90Y射线辐射后凋亡细胞数量随时间延长而逐渐增多，与间质细胞比较，腺上皮细胞凋亡更加明显，说明辐射能使增生的前列腺细胞发生凋亡，而前列腺的腺上皮对于辐射更加敏感6。    前列腺细胞凋亡过程中，由于细胞浆和染色质浓缩、核裂解，产生凋亡小体，使细胞的光散射性质发生变化，通过流式荧光细胞仪的分析显

16、示，射线辐射可使前列腺组织细胞周期时相发生改变，凋亡细胞核在二倍体峰前出现亚二倍体峰“凋亡峰”，随着辐射后时间的延长，可检测到的凋亡细胞逐渐增多。    前列腺细胞发生凋亡时的生物化学特征主要是细胞内发生一系列信号传递反应，有新的RNA和蛋白质合成，核酸内切酶被激活，染色质DNA被核酸内切酶降解，产生若干大小不一的多聚核苷酸片段，在琼脂糖凝胶电泳上呈现阶梯状图谱(DNA ladder)，利用这一特征可以对细胞凋亡进行检测。DNA琼脂糖凝胶电泳可见对照组基因组DNA保持完整，经射线辐射7 d后基因组DNA发生断裂，呈现典型的凋亡改变即DNA ladder，表明射线可

17、使细胞核内DNA在核小体连接处发生断裂，形成180200 bp及其整数倍的核苷酸片段。本实验通过TUNEL染色、流式细胞术和琼脂糖凝胶电泳等方法证实，射线内照射能够有效地使人增生的前列腺细胞凋亡，进而引起前列腺组织萎缩，为采用电离辐射治疗BPH提供了实验依据。    【参考文献】  1 Kyprianou N.Doxazosin and terazosin suppress prostate growth by inducing apoptosis：clinical significanceJ.J Urol，2003；169(4)：15205.

18、    2 Iacopino F，Angelucci C，Lama G，et al.Apoptosisrelated gene expression in benign prostatic hyperplasia and prostate carcinomaJ.Anticancer Res，2006；26(3A)：184954.    3 Ma QJ，Gu XQ，Cao X，et al.Effect of beta radiation on TGFbeta1 and bFGF expression in hyperplastic prostatic tissuesJ.Asian J Androl，2005；7(1)：4954.    4 马庆杰，谷欣权，曹 霞，等.辐射对前列腺增生组织中bcl2和bax表达的影响J.中国老年学杂志，2003；23(5)：2812.    5 Justulin LA，Delella FK，Fe