反相高效液相色谱法测定盐酸博安霉素含量_图文

1、.30. 中国抗生素杂志2011年1月第36卷第1期 文章编号:10018689(2011Ol一0030-03反相高效液相色谱法测定盐酸博安霉素含量鲁敏1许鸿章I尹利辉2张瑞I陈汝贤I+(1中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所,北京100050:2中国药品生物制品检定所,北京100050摘要:目的 建立反相高效液相色谱法测定博安霉素含量的方法。方法采用AgilefIt ZORBAX Eclipse PhsC。(4.6n-anX 150hen, 5岬色谱柱,流动相为0.005mol/L己烷磺酸钠离子对溶液(pH4.3:甲醇:乙腈(72:21:7,柱温22"(2,流速ImL/

2、min,检测波长 254nm。结果 博安霉素在0.0752.4mg/mL范围内,浓度与峰面积呈良好线性关系,相关系数R=0.9999。结论此方法操作简 便、快捷、准确,重现性好,既可以用于博安霉素产品的质量分析,也可用于生产中间品的质量控制。与平阳霉素检测方法相 比,采用此方法博安霉素与博莱霉素族其他组分的分离效果更好。关键词:反相高效液相色谱;博安霉素;平阳霉素;博莱霉素中图分类号:R927.2文献标识码:AContent determination of boanmycin hydrochloride by RP-HPLCLu Minl,Xu Honezhan91,Yin Li-hui2,

3、Zhang Ruil and Chen Ruxianl(1Institute ofMedicinal Biotechnology&Peking Union Medical College,Chinese Academy ofMedical Sciences,Beijing 100050; 2National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050Abstract 0bi ective To establish all RPHPLC method for dete

4、rmination of the content of boanmycin. Methods T11e HPLC condition was弱follows,column,Agilent ZORBAX Eclipse PlusCIR(4.6mmx 150mm,5pro;temperature,22:mobile phase,0.005mol/L sodium 1.hexanesulfonate(pH adjusted to 4.3:methanol:acetonitrile (72:2l:7、:flow rate:1.0mL/min;UV detection wave length,254nm

5、.Results The calibration curve for peak area of boanmycin was Iinear from 0.075to 2.4mg/mL(尺=0.9999.Conclusion The method iS simple,quick,accurate, reproducible and suitable for quality analysis of boanmycin and quality control ofintermediate.The resolution of boanmycin from other components of bleo

6、mycin family was bener than that of pingyangmycinS test method by this method.Key words RP.HPLC;Boanmycin;Pingyangmycin;Bleomycin博安霉素(boanmycin是一个新的抗肿瘤抗生 素,国家一类新药,是从我国浙江的土壤中分离得 到的一株链霉菌(轮枝链霉菌平阳变种产生的博莱霉 素类抗肿瘤物质【】。我国从60年代末就开始了对博莱 霉素类的研究和开发,时称争光霉素,其中第一大 组分平阳霉素(博莱霉素A5单组分已于80年代初投 产,并收入国家药典和国家基本药物,在肿瘤临床 化疗

7、上发挥了很好的作用。博安霉素是我们继平阳 霉素之后开发的又一个新的抗肿瘤抗生素,它最大 的优点是肺毒性显著低于平阳霉素和博莱霉素,除 对头颈部癌、皮肤癌、肺癌、食管癌、淋巴癌有较 好作用外,对肝癌也有较好的疗效,现已正式投产 进入市场。其化学结构与博莱霉素A6一致fl】。由于博安霉素与博莱霉素族的其他产品一样均收稿日期:2010-03-01基金项目:“重大新药创制”科技重大专项(编号:2009zx 09301-003作者简介:鲁敏,女,生于1960年,副主任技师,主要从事微生物及天然产物的分离提取工作。通讯作者,E-mail:chrx888sohu.corn反相高效液相色谱法测定盐酸博安霉素含

8、量鲁敏等 .31. 为微生物发酵产物,又具有结构上的相似性,所以在含量测定上有一定的困难。日本曾用CM.sephadex c.25NH4+】柱层析法进行梯度洗脱,分份收集样品, 测定紫外吸收度,以此计算各组分的含量,此方法 既繁琐又费时,且不适合于测定纯度较差的复合 物,无法进行生产过程中间产品的质量控制。美国药典UsP28-NF23【21和有关文献【3噌报道用反 相离子对梯度洗脱法测定博莱霉素复合物的组分, 流动相用离子对试剂戊烷磺酸钠与甲醇进行梯度洗 脱,但一次测定需要80min。中国药典1995年版中平 阳霉素的含量测定方法也采用HPLC法,但改梯度洗 脱为固定比例洗脱41。在博安霉素生

9、产质量标准建立 时,关于博安霉素的含量测定,我们借鉴了平阳霉 素含量测定的方法【5】,考察了不同流动相比例和不同 pH对检测结果的影响,对分析条件作进一步改进, 最终将戊烷磺酸钠改为己烷磺酸钠,并调整流动相 比例,达到了与博莱霉素族其他组分的良好分离。 l仪器与试药岛津液相色谱仪(LC.10AT泵,SPD.M10A-极管 阵列监测器,COT-10A柱温箱,Clase.vpT作站。 博安霉素对照品(天津太河制药公司提供。己烷磺酸 钠离子对试剂:天津试剂二厂生产,0.25mol/L,每 支20raL。2色谱条件色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C。 (4.6mmX 1

10、50mm,5邮吣;流动相比例:0.005mol/L己 烷磺酸钠溶液:甲醇:乙腈(72:21:7;柱温22; 流速lmL/min;检测波长254nm。0.005mol/L己烷磺酸 钠离子对溶液配制:取己烷磺酸钠离子对试剂一支, 加975mL水和5mL冰醋酸,用氨水调pH4.3。3方法与结果3.1线性考察15010050O3一芝嚣陋图1博安霉素的标准曲线Fig.1Standard curve ofboanmycin精密称取博安霉素对照品60mg置于25mL容量 瓶中,加水定容至刻度摇匀作为储备液,然后取 一定量储备液对倍稀释制得浓度为2.4、1.2、0.6、 0.3、0.15和0.0750mg/m

11、L的系列溶液进样测定, 采用外标法面积定量。结果以样品浓度(mg/mL 对色谱峰面积进行线性回归见图l,得回归方程为 Y-1.0×107X+125076,R=0.9999。再将样品逐级稀 释,当样品浓度为0.41上g/mL时,信噪比(S/N约为3, 得检测线。3.2精密度和重复性试验取一定量储备液配SUo.6mg/mL 5份,取一份连 续进样5次,RSD为0.89%,说明其重复性良好。用 上述样品在O、l、2、4、6、8h进样,其余样品置于 冰箱内分别在24、48、72、96h进样,得日内精密度 和日间精密度RSD分别为1.3%和0.87%,均能达到方 法学的要求。3.3分离度我们把

12、博安霉素、平阳霉素、博莱霉素(A2、B2的混合品、博莱霉素B4混合进样,博安霉素与其他 组分的分离度均可以达到1.5,见图2。3.4样品测定精密称取博安霉素对照品15.2mg置于25mL容量 瓶中,加水定容至刻度摇匀作为对照液,其含量以O lO 15202530 t/minl:博莱霉素A2;2:平阳霉素;3:待鉴定组分;4;博莱霉素B2:5:博安霉素:6博莱霉素B4图2博莱霉素族的HPLC图Pig.2High performance liquid chromatography(HPLCof bleomycm family.32. 中国抗牛素杂志2011年1月第36卷第1期 中国抗生素杂志201

13、1年1月第36卷第1期表l不同批次样品含量测定结果Tab.1Results ofdifferent batches ofsamples无水物计算含博安霉素游离碱78.6%,另外分别称取 不周批号的样品以同法配制成待测液,分别平行进 样3次,用外标法以峰面积计算其含量,见表l。 4讨论关于含量,在博安霉素生产质量标准中规定,“以无水物计算含盐酸博安霉素fH晰N2。02。s2nHO, 不低于85%”。虽然每Imol/L盐酸博安霉素中理论上 应含6mol/L盐酸,但实际生产工艺中通过调节溶液 pH值4.56.5来保t正￥11剂处于稳定状态,故盐酸的数 目为变量,根据中国药典的惯例,含量以活性成分计

14、算,按每Imol/L盐酸博安霉素理论上含6mol/L盐酸计 算,盐酸博安霉素中博安霉素的理论含量为87.3%, 由于实际生产成品中盐酸的数目为变量,为了控制 生产工艺的稳定性,质量标准制定了含量的上下 限,为理论值的下限85.0%(85.O%×87.3%=74.2%, 理论值的上限105.0%(105.0%×87.3%=91.7%,即 “按无水物计算,含博安霉素(C。H,。N:。02。S:应为 74.2%91.7%”。另外在博安霉素的HPLC研究中,我们发现在流 动相比例及流速一定的条件下温度的变化对色谱峰 有很大的影响。当温度为20至1J25时博安霉素色 谱峰为单峰,高于

15、30时色谱峰将呈现双峰,当温 度升到60色谱峰又变成单峰,但已不是原来的单 峰,而是随温度提高新出现的单峰,这种变化可能 与博安霉素本身的质子化程度或构象有关。为了保 证含量测定的准确性我们通常把柱温控制在22。 由于将离子对试剂改为己烷磺酸钠,取得了较 采用戊烷磺酸钠更好的分离度,使得博安霉素与博 莱霉素族其他组分的分离效果更好。这样,该方法 不但用于博安霉素产品的定量,而且可以用于生产 过程中间体的分析。值得注意的是流动相中己烷磺 酸钠的pH值为4.3,要准确调整,因为pH值的微小变 化会影响到分离度。实验证明,用我们建立的高效液相色谱法检测 博安霉素的含量,操作简便快速,准确度高,重现 性好,既可以用于博安霉素产品的质量分析,也可 用于生产中间品的质量控制。参考文献f11许鸿章,戴丽华,张鹤镛,等.争光霉素A6和它在争光霉素 复合物中的地位J】.药学学报,1988,28(9:667671. 【2】The United States Pharmacopeial Convention,lne. USP28一NF23S.Canada by Webcom Limited,Toronto, Ontario,2005:271.【3】Klea R P'Chovan J P,Dansc I H R.Reversedphase paired-ion highper