α双炔失碳酯对激素依赖人前列腺癌细胞LNCaP生长的影响

1、?双炔失碳酯对激素依赖人前列腺癌细胞LNCaP生长的影响    【摘要】  目的 探讨双炔失碳酯单体（?anordrin, ?ANO）对激素依赖人前列腺癌细胞LNCaP生长的影响。 方法 采用氧化铝柱层析分离纯化双炔失碳酯(ANO)的和差向异构体，SRB细胞染色法检测?ANO对LNCaP细胞生长的影响及对抗雄激素拟似剂R 1881促细胞生长的作用；观察?ANO作用下细胞形态学变化；ELISA法检测?ANO对LNCaP细胞分泌前列腺特异性抗原（PSA）的影响。结果 常规培养液中?ANO（8,12,16,24,32 mol/L）作用LNCaP细胞后

2、，细胞存活率分别为85.8%，51.5%，40.8%，29.2%，1.0%；在去除激素培养液中，?ANO抑制细胞生长作用更强，能对抗R1881的促细胞生长作用，经?ANO处理的LNCaP细胞分泌PSA能力降低。 结论 ?ANO抑制激素依赖人前列腺癌细胞LNCaP的增殖，具有抗雄激素促细胞生长的作用。【关键词】  前列腺肿瘤; 去甲雄烷类； 选择性雌激素受体调节剂； 前列腺特异抗原； 细胞系，肿瘤ABSTRACT:  Objective  To investigate the effects of ?anordrin（?ANO）on the growth of an

3、drogen?dependent human prostate cancer cell line LNCaP.  Methods  The monomers of ?ANO and ?ANO were purified through alumina column chromatographic separation.  SRB staining method was used to detect the effects of ?ANO on the growth of LNCaP cells and on antagonizing R1881(a kind of

4、 androgen stimulant) in inducing LNCaP cells proliferation.  Cell morphology was examined under microscope.  ELISA was used to examine the effect of ?ANO on PSA secretion by LNCaP cells.  Results  In normal medium，after LNCaP cells were treated with ?ANO at 8,12,16,24 and 32 mol/

5、L，cell survival rates were 85.8%, 51.5%, 40.8%, 29.2%, 1.0% respectively.  In the androgen?depleted medium, ?ANO could antagonize LNCaP cell proliferation induced by R1881.  The PSA secretion of LNCaP cells was also decreased.  Conclusion  ?ANO inhibits the proliferation of andro

6、gen?dependent human prostate cancer cell line LNCaP.  In the presence of androgen, ?ANO antagonizes the LNCaP cell proliferation induced by androgen.   KEY WORDS:  prostatic neoplasms; noranotrostanes; selective estrogen receptor modulators; prostate specific antigen; cell line,

7、tumor选择性雌激素受体调节剂（selective estrogen receptor modulators,SERM）是指能与雌激素受体相互作用，依据靶组织和激素内环境的不同而产生特异作用的-类化合物。它们对雌激素有双相作用，即能抗雌激素又具有拟雌激素样作用。SERM已被证实可治疗乳癌、骨质疏松和心血管疾病；并可能预防前列腺癌（prostate cancer, Pca）1?2。寻找新的理想的SERM是目前研究热点。   双炔失碳酯（2，17?双乙炔基A环?失碳雄烷?2，17双羟基双丙酸酯,anordrin,ANO）是甾体A环失碳雄甾烷衍生物3，临床上用于抗着床、抗早孕。

8、药理活性研究表明ANO具有强的抗雌激素作用和弱的雌激素样活性4，与SERM类药物特点相似。文献报道，ANO在合成过程中，同时生成2个炔基构型不同的异构体: ?ANO和?ANO。?ANO对多种肿瘤细胞包括HL?60、人卵巢癌细胞等有直接杀伤作用5。笔者观察?ANO对激素依赖人前列腺癌细胞LNCaP生长的影响，报道如下。1  材料和方法1.1  材料1.1.1  试剂与仪器  ANO（上海信谊医药集团），纯度均>99%；R1881（Methyltrienolone，美国加洲大学洛杉矶分校癌症中心陈德桂博士惠赠）；RPMI 1640培养基，IMDM，无酚

9、红IMDM，胎牛血清，活性炭处理的血清(CS?FBS)，含0.02%EDTA胰酶（美国Gibco公司）；前列腺特异抗原（prostate specific antign,PSA)ELISA试剂盒（美国DSL公司）；罗丹明B(SRB)（美国Sigma公司）；CO2培养箱（美国Forma Scientific公司）；倒置相差显微镜（日本Olympus 公司）；酶标仪550型（美国Bio?Rad公司）。1.1.2  细胞株与细胞培养  人前列腺癌细胞LNCaP（美国加洲大学洛杉矶分校癌症中心陈德桂博士惠赠）。LNCaP培养于含10%胎牛血清、青霉素100 IU/mL、链霉素100

10、 IU/mL的IMDM培养液中，细胞贴壁成簇生长，与底物贴附力弱，增殖慢，倍增时间为72 h，细胞间粘连紧密，需用含0.02% EDTA的0.25%胰酶消化。每5天换液1次，每8天传代1次。细胞培养于37 恒温，体积分数为0.05的CO2，饱和湿度的培养箱中。1.2  方法1.2.1  氧化铝柱层析法分离纯化药物  取，?ANO混合物1 g，以150氧化铝低压柱（E.Merck氧化铝G）分离，柱压0.5 kg/cm2，苯石油醚=21洗脱，每流分20 mL，各流分用上述流动相薄层条件检查，单一斑点流分合并。第611流分合并蒸干，用正已烷重结晶，得纯体120 mg，熔

11、点136137 ，第1822流分合并蒸干，得纯单体560 mg，熔点155156 。单体以无水乙醇配制成12.8 mmol/L的贮存液，临用前用培养液稀释至所需浓度，乙醇在培养液的最终体积分数不超过0.2%。1.2.2  SRB法检测?ANO对细胞生长的作用  取在常规培养液中生长的对数生长期的LNCaP细胞经充分消化后，接种于96孔板，细胞接种量约每孔8 000个，每孔100 L，24 h后细胞贴壁达到80%，?ANO组每孔加含不同终浓度?ANO（8,12,16,24,32 mol/L）的培养液100 L，对照组加等量培养液，设3个复孔，药物与细胞共孵育5 d，作用时间结

12、束时，用SRB染色法检测药物对细胞生长的抑制作用：每孔加入预冷的30三氯醋酸50 L，放置5 min后置4 固定1 h，吸弃固定液，去离子水洗5遍，甩干，空气干燥，每孔加入SRB液100 L，室温放置10 min，未与蛋白结合的SRB用1醋酸洗5遍，空气干燥，加入10 mmol/L的非缓冲Tris碱液150 L溶解，震荡15 min，515 nm波长处读取D值。计算各浓度组的存活率。   存活率=D加药组/D对照组×100%1.2.3  SRB法检测?ANO对抗雄激素的作用  参照文献6 用无酚红的IMDM与活性炭处理过的血清配制成特殊的去除激

13、素的培养液。细胞在加药物干预前在无激素培养液中预培养24 h以消除常规培养液中的激素对实验结果的干扰，在去除激素的培养液中细胞生长较为缓慢，细胞接种量提高至每孔10 000个。实验设:对照组(加等量培养液),?ANO（3,6,12,24 mol/L）与1 nmol/L R1881的单独与联合组，给药后各组终体积相同，每个加药组设3个复孔，与细胞共孵育5 d，SRB法染色，酶标仪测D值，计算各浓度组的存活率。1.2.4  细胞形态学观察  取常规培养液中生长的对数生长期的LNCaP细胞消化后，常规培养液稀释，接种于6孔板，细胞量每孔50 000个，加入含不同终浓度?ANO（3

14、,6,12,24 mol/L），对照组加等量培养液，药物作用48 h后，于相差显微镜下观察LNCaP细胞形态的变化。1.2.5  ELISA法测药物对细胞分泌PSA的影响  取对数生长期细胞，在去除激素的IMDM培养基中培养72 h后，以含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化液充分消化成单细胞悬液，接种于96孔板，细胞量约为每孔10 000个，每个浓度设3个复孔，每孔100 L，置培养箱孵育24 h，细胞贴壁后每孔加含不同浓度药液的培养液100 L，药物作用24 h后，吸取每孔上清，离心以去除上清中的少许细胞碎片。用收集到的上清液测PSA含量。为了消除由于细胞数量的变化而

15、造成的对PSA变化的影响，将每个浓度组的细胞数量用对照组细胞数量校正，计算抑制率。检测步骤按ELISA试剂盒说明书。1.3  统计学处理  计量资料以x±s表示，采用SPSS 13.0统计软件包分析，组间比较采用t检验。2  结果2.1  ?ANO对LNCaP细胞生长的影响  在常规培养液中，?ANO(8,12,16,24,32 mol/L)作用LNCaP细胞5 d后，细胞存活率分别为85.8%,51.5%,40.8%,29.2%,1.0%,低浓度表现为抑制生长,高浓度表现为细胞毒作用,呈剂量依赖性(图 1)。?ANO:双炔失碳酯单体

16、.图1  不同浓度?ANO对人前列腺癌LNCaP细胞增殖的影响（略）Fig 1  Proliferation of LNCaP cells treated with different dose of ?ANO2.2  ?ANO对抗雄激素的促生长作用  在无激素培养液中预培养24 h，LNCaP细胞经不同浓度?ANO和1 nmol/L R1881处理5 d后,呈现不同的增殖抑制情况。单独给予1 nmol/L R1881具有促细胞生长的作用，细胞存活率为120.8%；单独给予?ANO（3,6,12,24 mol/L）细胞存活率分别为92.9%,80.1%,

17、44.8%,22.1%。两者联合应用,R1881促细胞生长作用被完全抵消,存活率分别为77.9%,67.9%,37.2%,19.5%,与相同浓度无R1881组比较呈下降的趋势(图2)，与单独给予R1881组比较，差别有显著统计学意义（P<0.01）。2.3  细胞形态学变化  12 mol/L ?ANO作用于LNCaP细胞48 h,细胞数量减少,部分细胞发生变形,细胞变圆,体积变小;24 mol/L?ANO作用下LNCaP细胞形态发生明显变化, 细胞形状变圆,体积变小,部分细胞碎裂,细胞质空泡化,细胞表面变粗糙,呈现颗粒状,胞间粘连减少,细胞大部分为分散的个体。

18、60;   2.4  ?ANO对LNCaP细胞分泌PSA的影响  ?ANO能抑制LNCaP细胞分泌PSA，在1 nmol/L R1881存在下，?ANO抑制PSA分泌的作用更强。R1881本身可使LNCaP细胞分泌PSA增长近10倍，?ANO作用细胞24 h后，细胞数量变化不大，最高给药剂量15 mol/L，细胞数量相当于对照的90%，而细胞分泌的PSA量只有对照的35%左右，降低幅度远远大于细胞数量的变化。有R1881组，在?ANO 浓度为1 mol/L和5 mol/L时，抑制率均高于无R1881组（P0.01）（图3）。?ANO:双炔失碳酯

19、单体.  n=3.  与对照组比较,:P<0.05, :P<0.01； 与R1881比较,#:P<0.01.图2  ?ANO在有和无R1881存在下对人前列腺癌LNCaP细胞生存率的影响（略）Fig 2  Survival of LNCaP cells treated by ?ANO in the presence or absence of R1881?ANO:双炔失碳酯单体.图3  ?ANO对人前列腺癌LNCaP细胞分泌PSA的影响（略）Fig 3  Effect of ?ANO on PSA secretion

20、 in LNCaP cells3  讨论   Pca是与激素密切相关的恶性肿瘤，其发病与体内雄激素与雌激素之间的平衡紊乱有关，雄激素及其受体(androgen receptor,AR)在前列腺癌变过程中起主导作用；雌激素及其受体(estrogen receptor,ER)在前列腺癌作用尚不清楚，有学者认为雌二醇（estradiol,E2）导致老年动物高分级的前列腺上皮内瘤，E2的增加可能上调AR对睾酮的敏感性7。   ANO在我国于20世纪60年代首次合成，早期作为避孕药应用于临床，效果良好。ANO的抗生育作用主要是因其具有较强的抗雌激素作用，

21、但药理研究表明ANO也有弱雌激素活性，具有与SERM类药物相似特点。目前国外已有多种SERM类药物用于Pca预防和治疗的实验研究1?2。   本实验结果显示，常规培养液中?ANO作用LNCaP细胞5 d，对细胞生长呈现剂量依赖性的抑制作用。LNCaP是典型的激素依赖性细胞，含有突变型AR，可表达AR和ER，并能产生人类前列腺酸性磷酸酶和 PSA，在雄激素刺激下，LNCaP细胞生长增快8。本实验中1 nmol/L R1881与LNCaP细胞共孵育5 d，促生长作用可达1.2倍左右，R1881是一种合成的雄激素受体激动剂9，是目前国外常用的替代雄激素的实验试剂。1 nmol/L

22、 R1881刺激LNCaP细胞的生长，但在同时含有?ANO和R1881组,这部分促生长作用被完全抵消,存活率与相同浓度无R1881组比较反而下降，表明?ANO在雄激素存在时，对细胞抑制作用增强，能对抗雄激素引起的细胞增殖。   PSA由前列腺上皮细胞产生，在腺体的腺泡和上皮细胞内合成，其合成分泌由雄激素受体调控，与雄激素成正相关，是目前Pca治疗的敏感的指标之一。ELISA检测结果表明，雄激素能使 LNCaP分泌PSA升高近10倍，而?ANO能显著对抗由雄激素引起的PSA增加。这个结果再次证实了?ANO具有对抗雄激素的作用。由于早期 Pca是激素依赖性，体内的细胞增殖主要由

23、于雄激素水平的升高引起10，?ANO对抗雄激素的特点在Pca早期治疗中具有一定的潜在价值。但是，?ANO抗雄激素作用与其抗雌激素和弱雌激素样作用有何联系，通过何种机制实现，?ANO抗Pca的活性与AR及ER之间有何关系,均有待进一步研究。【参考文献】  1 Neubauer B L, McNulty A N, Chedid M, et al. The selective estrogen receptor modulator trioxifene (LY133314) inhibits metastasis and extends survival in the PA rat pro

24、static carcinoma modelJ. Cancer Res , 2003, 63(18) :6056?6062.2 Price D, Stein B, Golubbff E, et alToremifene for the prevention of prostate cancer in men with high grade prostatic intraepithelial neoplasia：results of double?blind, placebo?controlled phase B clinical trial JUrol, 2006,176(3):965?971

25、.3 刘 静,郑 伟,陈海林,等 新型A环失碳甾体化合物的合成及其抑制黄体细胞的生物活性J生殖与避孕, 2005,25(5):272?2764 曹 霖,吴师龙,顾芝萍双炔失碳醇酯和双炔失碳酯的雌激素活性与抗生育作用关系的探讨J生殖与避孕, 1993,13(5):336?3415 楼丽君,胥 彬?双炔失碳酯诱导人早幼粒白血病HL?60细胞分化J中国肿瘤临床, 1999,26 (10):739?7426 Fukuchi J, Hiipakka R A, Kokontis J M, et alAndrogenic suppression of ATP?binding cassette transporter A1 expression in LNCaP human prostate canc