森林植物检疫-第5章检验

1、v样品和取样样品和取样w昆虫、螨类和杂草种子的昆虫、螨类和杂草种子的检疫检疫检验检验x植物病原真菌的检疫检验植物病原真菌的检疫检验y植物病原细菌的检疫检验植物病原细菌的检疫检验y植植物病毒和植原体的检验检疫物病毒和植原体的检验检疫y植物线虫的检验检疫植物线虫的检验检疫y植物检疫新技术植物检疫新技术复习思考题检验技术应符合以下检验技术应符合以下基本要求基本要求：灵敏度高，准确可靠灵敏度高，准确可靠，能检出低量有害生物；，能检出低量有害生物；简单、快速、方便易行简单、快速、方便易行；要有要有标准化的操作规程标准化的操作规程，检验，检验结果重复性好结果重复性好；安全安全，不会造成有害生物的扩散。，不

2、会造成有害生物的扩散。国家级重点实验室；区域性中心实验室；常规实验室国家级重点实验室；区域性中心实验室；常规实验室建筑条件建筑条件检疫实验室检疫实验室（检验室检验室）- -病、虫、草病、虫、草标本室标本室预处理室预处理室消毒处理室消毒处理室人员人员条件条件林学、森林保护或相关专业领域高级技术人才或复合型专业技术人才林学、森林保护或相关专业领域高级技术人才或复合型专业技术人才仪器设备条件国家级国家级重点实验室应具备重点实验室应具备显微成像系统显微成像系统、酶联检测仪酶联检测仪等等仪器设备仪器设备-快速反应和应急能力快速反应和应急能力地区性地区性中心实验室应具备中心实验室应具备显微镜显微镜、解剖镜

3、解剖镜、普通冰箱普通冰箱、水浴箱（或温箱）水浴箱（或温箱）、离心机离心机和必要的和必要的摄像器材摄像器材、消毒消毒和和污物处理污物处理等设备等设备常规常规实验室应具备病、虫、杂草检验所需的基本设备，实验室应具备病、虫、杂草检验所需的基本设备，如如放大镜放大镜、解剖镜解剖镜、无菌操作台无菌操作台等等实验室管理实验室管理资质认定证书的资质认定证书的有效期为有效期为3 3年年。国家级国家级实验室的资质认定，由实验室的资质认定，由国家认监委国家认监委负责负责实施；实施；地方级地方级实验室的资质认定，由实验室的资质认定，由地方质检部门地方质检部门负负责实施。责实施。称取样品洗脱孢子（振荡）离心富集镜检计

4、数1:11:1或或1:21:2；振荡；振荡5-10 min5-10 min以以2500-3000r/min2500-3000r/min低速离心低速离心10-15 min10-15 minA A视野推算法视野推算法B B血细胞计数板测定法血细胞计数板测定法孢子生活力测定孢子生活力测定取一份样品（约取一份样品（约100100粒或粒或5 g5 g），按上述步骤所得的沉淀物，用），按上述步骤所得的沉淀物，用0.5 0.5 mlml蒸馏水悬浮后，用吸管吸取蒸馏水悬浮后，用吸管吸取1 1滴悬浮液放在载玻片上。镜检滴悬浮液放在载玻片上。镜检至少至少观察观察5 5个玻片个玻片，每个玻片上检查，每个玻片上检查1

5、010个视野的孢子数量个视野的孢子数量，求出每个视，求出每个视野的平均孢子数。同时，算出每一视野的面积及整个盖玻片的面积，野的平均孢子数。同时，算出每一视野的面积及整个盖玻片的面积，以及全玻片的视野数。再以以及全玻片的视野数。再以视野数视野数乘以每一视野上平均孢子数，再乘以每一视野上平均孢子数，再乘以乘以0.5 ml0.5 ml水的滴数水的滴数，即得，即得100100粒种子或粒种子或5 g5 g样品中的孢子总数，算样品中的孢子总数，算出每粒种子或每克种子的带菌量。出每粒种子或每克种子的带菌量。无菌吸水纸（3层）灭菌培养皿 吸水11.5cm培养、观察12h光照黑暗交替恒温所观察到的结果示意图如下

6、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDAPDA）、麦芽浸汁琼脂培养基（）、麦芽浸汁琼脂培养基（MEAMEA）、）、燕麦粉琼脂培养基（燕麦粉琼脂培养基（OMAOMA）常用接种方法常用接种方法:拌种接种拌种接种;浸种接种浸种接种;花期接种；整株喷雾接种花期接种；整株喷雾接种用化学方法或机械剥离方法分解种子，分别收集需要检查的胚或种用化学方法或机械剥离方法分解种子，分别收集需要检查的胚或种皮等部位，经脱水和组织透明处理后，镜检菌丝体和卵孢子。皮等部位，经脱水和组织透明处理后，镜检菌丝体和卵孢子。以检测大麦种子传带的散黑穗病菌为例，其操作过程如下：以检测大麦种子传带的散黑穗病菌为例，其操

7、作过程如下：u先将种子在加有锥虫蓝的先将种子在加有锥虫蓝的5 5氢氧化钠溶液中浸泡氢氧化钠溶液中浸泡22h22h，u然后用然后用60-6560-65的热水冲击或小心搅动，使的热水冲击或小心搅动，使种胚分离种胚分离，并用孔径，并用孔径分别为分别为3.5 mm3.5 mm、2.0 mm2.0 mm和和1.0 mm1.0 mm三层三层套筛收集种胚套筛收集种胚。u种胚用种胚用9595乙醇脱水乙醇脱水2 min2 min，再转移到装有，再转移到装有乳酸酚和水乳酸酚和水（3:13:1）混）混合液的合液的漏斗漏斗中，胚漂浮在上部，夹杂的种子残屑沉在底部并通过连中，胚漂浮在上部，夹杂的种子残屑沉在底部并通过连

8、在漏斗下端的胶管排出。在漏斗下端的胶管排出。u纯净的种胚用纯净的种胚用乳酸酚煮沸透明乳酸酚煮沸透明2 min2 min，冷却后用实体，冷却后用实体显微镜检查显微镜检查并计数含有散黑穗菌菌丝体的种胚，计算带菌率。并计数含有散黑穗菌菌丝体的种胚，计算带菌率。植物繁殖材料的入境后隔离检疫植物繁殖材料的入境后隔离检疫。供试材料种植在经过高压蒸汽灭菌处理或干供试材料种植在经过高压蒸汽灭菌处理或干热灭菌的土壤、沙砾、石英砂或各种人工基热灭菌的土壤、沙砾、石英砂或各种人工基质中，在隔离场所和适宜条件下栽培，质中，在隔离场所和适宜条件下栽培，根据根据幼苗和成株的症状鉴定幼苗和成株的症状鉴定。a用溶入丙酮的硝酸纤维素或指甲油用溶入丙酮的硝酸纤维素或指甲油包被包被L形玻棒形玻棒b用包被缓冲液（0.05 mol/ L碳酸缓冲液，pH 9.6）稀释抗血清，将包被有指甲油的玻棒放在抗血清抗血清中孵育孵育，27 孵育1 h或于4 过夜。设置对照：正常血清和包被缓冲液。c用RT缓冲液（NaCl:2.0 g，KCl:0.05 g，CaCl2:0.05 g，NaHCO3:0.25 g，KH2PO4:1.25 g，吐温20:1.00 ml，蒸馏水:1 000 ml，PH 7.4）淋洗玻棒淋洗玻棒3次，每次1 mind用RT缓冲液配置所测样品悬浮