实验二乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药

1、实验二乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药目前有机磷、氨基甲酸酯类农药是我国大量使用的杀虫剂，虽然这类农药与过去使用的有机氯农药相 比，降解速度较快，但在果蔬中的残留仍然较为严重。由于该类农药能抑制人体内乙酰胆碱酯酶的生理活 性，神经传导因此受阻，引起神经麻痹乃至死亡，对人类健康造成极大危害。对于果蔬中的农药通常采用 气相色谱等方法进行分析，但分析时间长，操作步骤烦琐，适用于实验室分析。长期以来在大部分果蔬市 场中，通常采用乙酰胆碱酯酶抑制法进行快速检测，即以乙酰胆碱酯酶作为检测试剂，采用农药残留检测 仪，根据乙酰胆碱酯酶活性变化的程度来测定果蔬样品中的残留农药。一、 实验目的1. 了解

2、果蔬中残留农药的分析方法；2. 掌握酶抑制分析方法的原理及操作方法；3. 理解农药残留性评价的意义。实验原理有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性，造成神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，使昆虫中毒致死，酶抑制法就是根据这一昆虫毒理学原理，对农药残 留进行检测。以乙酰胆碱为底物，在乙酰胆碱酯酶（ACHE）的作用下，乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，胆碱和二硫双对硝基苯甲酸（DNTB ）产生显色反应，使反应液呈黄色（于410nm处有最大吸收峰）。根据酶促反应动力学原理，在没有有机磷和氨基甲酸酯类农药存在时，底物在酶的催化作用下发生水解，反应速率可以用吸光度值随时间

3、的变化率Ko来表示。当有机磷和氨基甲酸酯类农药加入到酶的显色体系中时，农药抑制了酶的活性，影响显色体系的反应速度，此时体系吸光度随时间的变化率为Kt,则有机磷和氨基甲酸酯类农药对酶的活性的抑制率Y的计算公式如下：Y 二L 100%KoKo：空白样品的吸光度随时间变化曲 率值Kt：样品溶液的吸光度随时间变化曲 率值吸光度AKoKt线的斜线的斜计算。 定一次 点如下t1234567AA1A2A3A4A5A6A7其中Ko和Kt都可通过以下过程进行推导和 在样品的测量过程，选取每隔等步长时间测 吸光度值，3分钟内共测定7个数据点。设数据 表：则线性回归所得 At曲线的斜率K为：1 ,二.ti Ajt

4、i 二.Ai7K =Zti2-1ti)271(A12A23A34A45A56A67A7)(127)(AA2A7)(12 2272) (1 27)23(A7 - Ai) 2(A6 - A2) (A5 - A3)- 283lg(二2lg(J ) |g(JI7 I 0I 6 I 0 山 I 0- 281112133lg() 2lg(产)lg()1 71 61 5- 28由此结果可以看出，K值的求取可以不需要使用I0值，即实验中不需要使用蒸馏水来校正I0值，在光源具有稳定性的前提下(通过仪器的硬件电路实现)，I。值对测量结果不会有影响，这样就可以简化步骤，只用测岀空白样品和实际样品溶 液的光强li 丨

5、7,计算岀K0和Kt，最后得岀抑制率 Y值。采用乙酰胆碱酯酶测定残留农药时，当酶完全水解底物乙酰胆碱时，溶液显黄色，其抑制率为0%，当酶活性被农药抑制而部分水解乙酰胆碱，测定溶液显淡黄色，出现相应的抑制率，当酶完全被农药抑制，测定溶液显无色，抑制率为100%，这样就可以建立起农药残留量与酶活性抑制率之间的关系。因而可以通过测定抑制率的大小来显示农药残留的毒性程度。样品的毒性等级分为：安全、低毒和高毒。毒性等级 和抑制率之间的关系如下：表4-4抑制率和毒性等级的关系抑制率Y毒性等级< 20%20% 50%> 50%安全低毒咼毒仪器和试剂.仪器农药残留检测仪1台天平(0.01g)1台组

6、织捣碎机1台一次性手套1双金属镊子1支试管架1个移液管架1个20mL离心试管3支10mL具塞试管4支5mL吸量管5支1 mL吸量管3支(或移液枪(50-250卩L )1 套)2. 试剂提取液：将两袋粉剂倒入 500mL瓶内，加入510mL蒸馏水，摇匀溶解后备用。稀释液：将两袋粉剂倒入 250mL瓶内，加入100mL蒸馏水，摇匀溶解后备用。酶液：每瓶酶粉加 2.6mL稀释液，摇匀后置 4C备用，配好的酶液在 4C下可使用7天。底物：每瓶底物粉剂中加入 2.6mL蒸馏水，摇匀后置 4 C备用，配好的底物液在 4 C下可使用3天。 冷冻保存可使用15天。显色剂：将二袋显色剂粉剂混合瓶内，加入32mL

7、稀释液，摇匀溶解置 4C下备用。四、实验步骤1. 样品预处理戴上手套将蔬菜样品剪成约1cm2,用天平准确称取1g剪碎后的蔬菜样品放入 20mL离心试管中，；加入5mL提取液浸没叶片，不断摇振5min，静置20min后，取上清液2.5mL置于10mL具塞试管中待用。2. 样品测定空白样品的测量：向 1支10mL具塞试管中依次加入 2.5mL提取液，0.1mL酶液，0.1mL显色齐山混匀后将试管放入37C水浴中放置15分钟，15分钟到达时，马上加入 0.1mL底物混匀，约1分钟后倒入比色皿中放入农药残留检测仪进行空白测定，记录3分钟内仪器显示的光强值11、12、14、15、16、17，计算K。同时

8、做3份平行样。(2)待测样品的测量：向盛有待测样品提取液的具塞试管中，依次加入0.1mL酶液，0.1mL显色剂混匀，将试管放入 37C水浴中放置15分钟，15分钟到达时，马上加入0.1mL底物混匀，约1分钟后倒入比色皿中放入农药残留检测仪进行测定，记录3分钟内仪器显示的光强值I1 ' I2'I3' 14' I5' 16' I7'计算Kt。同时做3份平行样。并且计算样品的抑制率Y，判断毒性等级。五、数据处理通过下列公式计算蔬菜样品的抑制率，并判断毒性等级。I1I 2I33lg(p 2lg(产)lg(f)I 7I 6I 5Koi-(i=1,2,3)28K01' K02' K03K 03I1'I2'I3'3lg(=) 2lg(f) lg()K