实验6+DNA酶切、连接及电泳检测

1、 质粒在正常情况下以共价闭合环状质粒在正常情况下以共价闭合环状cccDNA构型构型(超螺旋超螺旋scDNA)存在存在，在提取过程中由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能会使，在提取过程中由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能会使DNA链发链发生断裂。所以，多数质粒粗提物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状生断裂。所以，多数质粒粗提物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状/超超螺旋螺旋DNA(cccDNA)；开环；开环DNA(ocDNA）；线形）；线形DNA(LDNA)质粒质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式图琼脂糖凝胶电泳模式图M pUC19环形质粒环形质粒DNA超螺旋粒超螺旋粒DNA实验六实验六DNADN

2、A的酶切、连接及电泳检测的酶切、连接及电泳检测实实 验验 步步 骤骤（一）质粒（一）质粒DNADNA酶切酶切( (注：每人一管）注：每人一管）在在200l 200l 的薄壁离心管中，按照下表加入试剂（单位：的薄壁离心管中，按照下表加入试剂（单位：ll）混匀；点动离心将反应液甩至管底。混匀；点动离心将反应液甩至管底。37(PCR37(PCR仪仪) )保温保温1-2h1-2h进行酶切反应。进行酶切反应。反应结束后，反应结束后， 75 75，保温，保温10min10min使酶失活。使酶失活。电泳检测电泳检测 酶切酶切（二）（二） DNA DNA片段的连接片段的连接( (注：每人一管）注：每人一管）取

3、取200 l200 l的离心管按下表加入试剂。的离心管按下表加入试剂。混匀后点动离心，将溶液甩至管底混匀后点动离心，将溶液甩至管底置于已调好温度为置于已调好温度为12-16PCR12-16PCR仪中仪中保温保温1-2h1-2h后取出后取出电泳检测电泳检测 连接连接（三）质粒酶切样品和（三）质粒酶切样品和DNADNA连接样品的电泳检测连接样品的电泳检测琼脂糖凝胶的制备：制备琼脂糖凝胶的制备：制备2 2块块0.7% 0.7% （0.28g/40ml0.28g/40ml）和）和2 2块块1.2%1.2%琼脂糖琼脂糖凝胶（凝胶（0.48g/40ml0.48g/40ml）。）。 （注：全班制备（注：全班

4、制备4 4块胶）块胶）1、掌握限制性内切酶的特性及酶切体系的建立；、掌握限制性内切酶的特性及酶切体系的建立；2、了解影响酶切的因素；、了解影响酶切的因素；3、掌握、掌握DNA连接酶的性质以及连接体系的建立；连接酶的性质以及连接体系的建立；4、了解影响连接反应的因素。、了解影响连接反应的因素。实实 验验 目目 的的通过通过DNADNA重组技术构建重组技术构建DNADNA重组子重组子 利用利用限制性核酸内切酶切割限制性核酸内切酶切割DNA+利用利用DNA连接酶连连接酶连接接DNA是是DNA重组过程中的关键步骤之一。重组过程中的关键步骤之一。 成功的酶切和有效的连接为后续的外源基因进入宿主成功的酶切

5、和有效的连接为后续的外源基因进入宿主细胞进行表达提供了有效的实验材料。细胞进行表达提供了有效的实验材料。限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现1965年年Werner Arber第一个第一个描述了限制性内切现象描述了限制性内切现象；Hamilton O. Smith第一个第一个纯化了限制性内切酶纯化了限制性内切酶，并鉴定了，并鉴定了其性质；其性质；Daniel Nathans用这些酶将用这些酶将SV40病毒的病毒的DNA切割成了特定切割成了特定的片段，并绘制了的片段，并绘制了SV40病毒基因组的病毒基因组的“物理图谱物理图谱”。1978年这三人获得了当年的年这三人获得了当年的Nobel奖。奖。A

6、rber W. Smith H.O. Nathans D. 第一个第一个DNA重组分子重组分子1972年年Paul Berg等人利用限制性内切酶等人利用限制性内切酶EcoRI和和连接酶获得了第一个连接酶获得了第一个DNA重组分子。标志着遗传工重组分子。标志着遗传工程的开始。程的开始。The Nobel Prize in Chemistry 1980 Paul Berg 通过通过DNADNA重组技术构建重组技术构建DNADNA重组子重组子酶切酶切连接连接实实 验验 原原 理理 酶切酶切 限制性内切酶（限制性内切酶（restriction endonuclease）:一种在特一种在特殊核甘酸序列处

7、殊核甘酸序列处水解双链水解双链DNA的内切酶。的内切酶。 限制性内切酶能限制性内切酶能特异性地结合特异性地结合于一段被称为限制性酶识于一段被称为限制性酶识别序列的别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链割双链DNA。 l 生物体内能识别并切割特异的双链生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种序列的一种内切核内切核酸酶酸酶。它是可以将。它是可以将外来的外来的DNA切断切断的酶，即能够限制异源的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对的侵入并使之失去活力，但对自己的自己的DNA却无损害却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。

8、由于这种切割作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在作用是在DNA分子内部进行的，故名分子内部进行的，故名限制性内切酶限制性内切酶。 根据限制酶的识根据限制酶的识别切割特性别切割特性、催化催化条件条件及及是否有修饰酶活性是否有修饰酶活性，可分为，可分为型、型、 型和型和型三类。型三类。DNA重重组技术中组技术中最常用的是最常用的是型酶型酶，切割，切割后得到的是后得到的是带粘性末端带粘性末端或平或平末端的末端的线性线性DNA。 型限制性内切酶既能催化宿主型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而的水解；而型限制性内切酶型

9、限制性内切酶只催只催化非甲基化的化非甲基化的DNA的水解。的水解。 型型切割位点则在下游切割位点则在下游 24-26bp 处处 。命名命名l 一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株个字母组成，第四个字母表示菌株(品系品系)。例如。例如，从，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限中提取的限制性内切酶称为制性内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如以编成不同的号，如H

10、indII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboII等。等。 II型限制性内切酶主要特点：型限制性内切酶主要特点：识别的专一核苷酸顺序最常见的是识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个个或或6个核苷酸，少数也有识别个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸个核苷酸以及以及7个、个、8个、个、9个、个、10个和个和11个核苷个核苷酸的。在分子克隆实验中使用最普遍的酸的。在分子克隆实验中使用最普遍的是那些识别是那些识别4个或个或6个碱基对的限制性内个碱基对的限制性内切酶。切酶。II 型限制性内切酶的识别顺序是型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称一个回文对称顺序，即有一个中

11、心对称轴，从这个轴朝两个方向轴，从这个轴朝两个方向“读读”都完全都完全相同。相同。这种酶的切割可以有两种方式：这种酶的切割可以有两种方式：粘性末端和平头末端。粘性末端和平头末端。如如: EcoRI的识别顺序为：的识别顺序为： 5 G A A T T C 3 3.C T T A A G 5回文结构的对称轴回文结构的对称轴 限制性内切酶的活性以酶的活性单位表示，限制性内切酶的活性以酶的活性单位表示，1 1个酶单位个酶单位（1 Unit1 Unit）指的是在指定缓冲液中，指的是在指定缓冲液中，3737下反应下反应60min,60min,完完全酶切全酶切1g1g的纯的纯DNADNA所用的酶量。所用的酶

12、量。 影响酶切的因素：影响酶切的因素：在酶切反应中，在酶切反应中，DNADNA的纯度、缓冲液的纯度、缓冲液中的离子强度、中的离子强度、Mg2+Mg2+等因素均可影响反应，一般可通过增等因素均可影响反应，一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切完全酶切。但应。但应该注意的是，过多的酶量和过长的反应时间会造成非特异该注意的是，过多的酶量和过长的反应时间会造成非特异性的酶切性的酶切( (星号活性星号活性) )。图图: :构建构建DNADNA重组子重组子材料、试剂及器具材料、试剂及器具1 1、材料与试剂、材料与试剂酶切反应：酶切反应：p标准标准pUC

13、19(2686bp) pUC19(2686bp) pEcoREcoR及其配套的酶切缓冲液及其配套的酶切缓冲液 检测：检测：p0.50.5TBETBE电泳缓冲液电泳缓冲液p6 6电泳载样缓冲液电泳载样缓冲液 、GoldviewGoldview、琼脂糖、琼脂糖2 2 、器具：、器具：p水平式电泳装置水平式电泳装置p电泳仪电泳仪, ,台式高速离心机台式高速离心机p恒温水浴锅（用恒温水浴锅（用PCRPCR仪代理）仪代理）p微量移液枪微量移液枪p微波炉或电炉微波炉或电炉p紫外透射仪紫外透射仪p照相机及其附件照相机及其附件实实 验验 步步 骤骤（一）质粒（一）质粒DNADNA酶切酶切( (注：每人一管）注

14、：每人一管）在在200l 200l 的薄壁离心管中，按照下表加入试剂（单位：的薄壁离心管中，按照下表加入试剂（单位：ll）混匀；点动离心将反应液甩至管底。混匀；点动离心将反应液甩至管底。37(PCR37(PCR仪仪) )保温保温1-2h1-2h进行酶切反应。进行酶切反应。反应结束后，反应结束后， 75 75，保温，保温10min10min使酶失活。使酶失活。电泳检测电泳检测 （三）质粒酶切样品、（三）质粒酶切样品、DNADNA连接样品的电泳检测连接样品的电泳检测琼脂糖凝胶的制备：制备琼脂糖凝胶的制备：制备2 2块块0.7% 0.7% （0.28g/40ml)0.28g/40ml)（四）加样及电

15、泳检测（四）加样及电泳检测1 1、酶切样品的检测、酶切样品的检测p酶切阴性对照（酶切阴性对照（M1M1）：）：pUC19pUC19标样标样 20l + 20l + 6X6X的的loading buffer loading buffer 4 4llp酶切样品：酶切样品：pUC19pUC19酶切样品酶切样品 20l+ 20l+ 6X6X的的loading buffer loading buffer 3 3ll(1) DNADNA连接酶连接酶是是19671967年在三个实验室同时发现的年在三个实验室同时发现的。它是一种。它是一种封闭封闭DNADNA链上缺口酶链上缺口酶，借助，借助ATPATP或或NA

16、DNAD水解提供的能量催化水解提供的能量催化DNADNA链的链的5-PO45-PO4与另一与另一DNADNA链的链的3-OH3-OH生成生成磷酸二酯键磷酸二酯键。但这两条链必。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA(T4DNA连接酶连接酶除外除外) )，而且必须是两条紧邻，而且必须是两条紧邻DNADNA链才能被链才能被DNADNA连接酶催化成磷酸二酯键。连接酶催化成磷酸二酯键。 常用的常用的DNADNA连接酶有两种：来自大肠杆菌的连接酶有两种：来自大肠杆菌的DNADNA连接酶连接酶和来自和来自噬菌体的噬菌体的T4DNAT4DNA连接酶连接酶。二者的。二

17、者的作用机理类似。作用机理类似。实实 验验 原原 理理 连接连接核酸片段可以通过核酸片段可以通过连接酶连接酶的作用的作用连接起来而获得连接起来而获得重组分子重组分子。DNA连接酶催化双链连接酶催化双链DNA分子中分子中相邻碱基的相邻碱基的5- PO4末端与末端与3-OH间形成间形成3,5-磷酸二酯键磷酸二酯键。一个一个DNA片段的片段的5-PO4末端与另末端与另一个一个3-OH末端相互靠近时，末端相互靠近时，在在DNA连接酶的作用下，有连接酶的作用下，有Mg2+, ATP存在的缓冲系统中存在的缓冲系统中可以被连接起来而形成重组分可以被连接起来而形成重组分子。子。DNADNA连接酶作用机制连接酶

18、作用机制实实 验验 原原 理理 连接连接酶酶焦磷酸根焦磷酸根酶酶-焦磷酸根焦磷酸根酶酶l T4 DNA连接酶作用机制：连接酶作用机制：T4 DNA连接酶作用分三步：连接酶作用分三步：(1) T4 DNA连接酶与辅助因子连接酶与辅助因子ATP形成形成酶酶AMP复复合物合物。(2) 酶酶AMP复合物结合到具有复合物结合到具有5磷酸基和磷酸基和3羟羟基切口的基切口的DNA上，使上，使DNA腺苷化腺苷化。(3) 产生一个产生一个新的磷酸二酯键新的磷酸二酯键，把缺口封起来，把缺口封起来.常用的常用的DNADNA连接酶是连接酶是T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶，其作用底，其作用底物是双链的物是双链的D

19、NADNA分子或分子或RNARNA：DNADNA杂交分子，杂交分子，可以连接粘性末端、平末端。可以连接粘性末端、平末端。T4 DNAT4 DNA连接酶的活性用连接酶的活性用WeissWeiss单位表示。单位表示。1 Weiss1 Weiss单位是指在单位是指在3737下下20min20min内催化内催化1nmol 1nmol 3232P P从焦磷酸根置换到从焦磷酸根置换到 ,- ,-3232P ATPP ATP所所需的酶量。需的酶量。l T T4 4DNADNA连接酶的最适反应温度为连接酶的最适反应温度为，为什么实，为什么实验中采用验中采用1414？1.1.粘性末端形成的氢键在低温下更稳定；粘

20、性末端形成的氢键在低温下更稳定；2. 2. 连接反应时间长，低温下酶不容易失活连接反应时间长，低温下酶不容易失活材料、试剂及器具材料、试剂及器具1 1、材料与试剂、材料与试剂连接反应：连接反应：pDNA/EcoT14 I : :由由1111条条DNADNA片段组成：片段组成：1932919329、77437743、6223bp6223bp、42544254、34723472、 2690 2690、18821882、14891489、925925、421421、74 bp74 bppT4 DNAT4 DNA连接酶及其配套的连接酶及其配套的 10 10连接缓冲液连接缓冲液检测：检测：p0.50.5

21、TBETBE电泳缓冲液电泳缓冲液p6 6电泳载样缓冲液电泳载样缓冲液 、GoldviewGoldview、琼脂糖、琼脂糖2 2 、器具：、器具：p水平式电泳装置水平式电泳装置p电泳仪电泳仪, ,台式高速离心机台式高速离心机p恒温水浴锅（用恒温水浴锅（用PCRPCR仪代理）仪代理）p微量移液枪微量移液枪p微波炉或电炉微波炉或电炉p紫外透射仪紫外透射仪p照相机及其附件照相机及其附件（一）（一）DNADNA片段的连接片段的连接( (注：每人一管）注：每人一管）取取200 l200 l的离心管按下表加入试剂。的离心管按下表加入试剂。混匀后点动离心，将溶液甩至管底混匀后点动离心，将溶液甩至管底置于已调好

22、温度为置于已调好温度为12-14PCR12-14PCR仪中仪中保温保温1-2h1-2h后取出后取出电泳检测电泳检测实实 验验 步步 骤骤（二）（二）DNADNA连接样品的电泳检测连接样品的电泳检测琼脂糖凝胶的制备：制备琼脂糖凝胶的制备：制备2 2块块1.2%1.2%琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（0.48g/40ml0.48g/40ml）。）。（三）加样及电泳检测（三）加样及电泳检测连接样品检测：连接样品检测：p/EcoT14 I /EcoT14 I 样品样品 5l 5l（M2M2）pDNADNA连接样品：连接样品：20 l l 恒压电泳恒压电泳: 130V : 130V 电泳至溴酚蓝离凝胶外端电泳至

23、溴酚蓝离凝胶外端1-2cm1-2cm处，大约处，大约30-4030-40分钟分钟观察观察: :紫外透射仪下观察电泳结果，并拍照记录。紫外透射仪下观察电泳结果，并拍照记录。实验预期结果实验预期结果质粒及酶切样品电泳预期结果质粒及酶切样品电泳预期结果从左至右：从左至右：1. /EcoT14 I DNA Marker2. pUC19质粒质粒3. pUC19质粒酶切样品质粒酶切样品 1 2 3质粒不同构型的电泳行为质粒不同构型的电泳行为线型线型DNA超螺旋超螺旋DNA1 2 3 4 5 6 1：-EcoT14 digest2,3：连接产物：连接产物4：pUC19质粒质粒5,6：酶切产物：酶切产物DNA片段的连接样品电泳预期结果片段的连接样品电泳预期结果 1： DNA/Eco14酶切片段酶切片段2-3：DNA/Eco14 酶切片段酶切片段的连接的连接 产物产物 l 1、连接缓冲液的影响：大体上缓冲液含有以下组分：、连接缓冲液的影响：大体上缓冲液含