生物界与生物学课件：23m

1、第四篇第四篇 遗传与变异遗传与变异23 重组重组DNA技术技术23 重组DNA技术l重组DNA技术，也称基因工程或遗传工程。l基因工程是指将特定的基因（即外源基因），通过载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受体细胞中与受体细胞的基因进行重组，并能增殖、表达，这样一种遗传学操作。l基因工程的目的:通过与优良性状相关的基因的重组，获得具有高度应用价值的新物种或新产品。23 重组DNA技术l基因工程的优点基因工程的优点克服物种间的屏障；有目的、有计划、有选择地加工制造各种生物制品；遗传育种、医学等研究和开发。23 重组DNA技术重组重组DNA技术技术23 重组DNA技术l 23.1 基因工程的相关技

2、术基因工程的相关技术l 23.1.1 核酸的分子杂交核酸的分子杂交l 1. DNA的变性与复性的变性与复性l DNA变性变性较高温度解链成单链。l DNA复性复性变性的DNA逐渐冷却，分离的两条单链双链的DNA。短链容易精确复性；长链复性较难。l 杂交分子杂交分子碱基序列大部分互补，可以复性。DNA与RNA之间，也一样。23 重组DNA技术l2. 分子探针寻找特定基因分子探针寻找特定基因l3. Southern印迹印迹 可以检测特定的DNA序列。l4. Northern印迹印迹 可以检测特定基因的表达情况。l5. 原位杂交原位杂交 可以检测特定细胞中某一基因的表达情况。23 重组DNA技术So

3、uthern印迹印迹23 重组DNA技术KNAT1的表达的表达23 重组DNA技术23 重组DNA技术l23.1.2 PCRl1. PCR技术的基本原理技术的基本原理l PCR反应过程： 双链DNA变性（9095）成为单链DNA；引物复性（37-60）同单链DNA互补序列结合； DNA聚合酶催化（70 75）使引物延伸。23 重组DNA技术PCR原理原理23 重组DNA技术l2. Taq DNA聚合酶聚合酶l3. 寡核苷酸引物寡核苷酸引物l4. PCR技术的应用技术的应用23 重组DNA技术23 重组DNA技术l 23. 2 工具酶工具酶l 23.2.1 限制性内切酶限制性内切酶l （1）限制

4、性内切酶的作用）限制性内切酶的作用识别DNA中特定核苷酸序列，使每条链的一个磷酸二酯键断开。l （2）限制性内切酶的类型）限制性内切酶的类型I型、II型和III型。 II型酶基因工程。l （3）限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名根据来源命名。如EcoR I 大肠杆菌（E. coli）、R株系、第一种。23 重组DNA技术l（4）限制性内切酶的识别序列）限制性内切酶的识别序列 能识别的特定核苷酸序列。46个碱基对组成，且碱基互补对称。只写单链的核苷酸序列。l（5）限制性内切酶的切割位点）限制性内切酶的切割位点II型酶切割位点在识别序列区内。23 重组DNA技术l6）切割片段的末端）切割片段的末

5、端lA.粘性末端粘性末端两条链末端交错对称。 5粘性末端 3粘性末端l B.平头末端平头末端 两条链末端平齐。23 重组DNA技术粘性末端粘性末端23 重组DNA技术l 23.2.2 DNA连接酶及其连接作用连接酶及其连接作用催化-PO4和-OH形成磷酸二酯键。l （1）E. Coli DNA连接酶连接酶大肠杆菌（E. Coli）基因组编码；连接具互补粘性末端的DNA片段。l （2）T4 DNA连接酶连接酶T4噬菌体DNA编码；既连接具互补粘性末端的DNA片段，也能连接平头末端。23 重组DNA技术l23.2.3 反转录酶反转录酶l从反转录病毒中制备得到的。l该酶能以具有3-OH 的DNA或R

6、NA为引物，以mRNA为模板从53聚合生成cDNA 。 23 重组DNA技术l23.3 基因基因(克隆克隆)的质粒载体的质粒载体l 基因载体基因载体运送外源DNA片段进入受体细胞。三个条件：有插入位点； 能在受体细胞内复制； 有筛选标记基因。23 重组DNA技术l23.3.1 质粒质粒l A.存在于细菌；蓝藻、绿藻、真菌。l B.染色体外裸露环状双链DNA分子，小的不足1500bp，大的100kb以上。l C.宿主细胞内能自主复制。松弛型和严紧型复制质粒。选用分子小和松弛型复制的质粒。23 重组DNA技术l23.3.2 质粒载体质粒载体pBR322lA.有复制起始点，能在受体细胞内复制；lB.

7、有2种筛选标记基因；lC.有允许外源DNA插入的位点；lD.有高的拷贝数。23 重组DNA技术pBR322图谱23 重组DNA技术l23.4重组重组DNA的基本步骤的基本步骤l23.4.1 获得目的基因获得目的基因l1. 构建构建cDNA文库和基因组文库分离目的基文库和基因组文库分离目的基因因l2. 用用PCR技术从基因组中扩增出目的基因技术从基因组中扩增出目的基因l3.人工合成人工合成DNA23 重组DNA技术l23.4.2 DNA分子的体外重组分子的体外重组l酶切和连接。23 重组DNA技术l23.4.3 重组重组DNA分子引入宿主细胞和筛选分子引入宿主细胞和筛选鉴定鉴定l1. 重组重组D

8、NA引入宿主细胞引入宿主细胞原核生物细胞是很好的受体细胞容易摄取外界的DNA，增殖快，基因组简单，便于培养和基因操作。大肠杆菌、蓝藻、农杆菌等。l2. 重组体克隆的筛选与鉴定重组体克隆的筛选与鉴定23 重组DNA技术蓝白斑筛选蓝白斑筛选23 重组DNA技术转基因植物筛选转基因植物筛选23 重组DNA技术l 23.5 基因工程的应用及其成果简介基因工程的应用及其成果简介l 基因工程干扰素、人生长素、人胰岛素、乙肝疫苗、红细胞生成素、血纤维蛋白溶酶原激活剂（溶栓药）等。l 基因工程农作物新品种也已在一些国家在大田种植，如抗虫棉、抗虫玉米、耐储黄瓜等。l 1. 生产新型疫苗生产新型疫苗l 2. 生产

9、人胰岛素生产人胰岛素l 3. 生产人生长激素生产人生长激素l 4. 生产干扰素生产干扰素23 重组DNA技术l5. 动、植物基因工程动、植物基因工程l转基因动物转基因动物l（1）模式动物）模式动物 模式动物可用来揭示生物学困难领域中的许多奥妙，像人脑、免疫系统和胚胎发育等。 在试验遗传病的新疗法中，模式动物也很有用。癌鼠；转基因猴。23 重组DNA技术23 重组DNA技术2008年诺贝尔化学奖 绿色荧光蛋白（GFP）Osamu Shimomura（下村修） Martin Chalfie（马丁沙尔菲） Roger Y. Tsien（钱永健，钱学森的堂侄）23 重组DNA技术GFP and dsR

10、ed23 重组DNA技术23 重组DNA技术23 重组DNA技术l（2）生物反应器动物）生物反应器动物生物反应器动物：利用其乳腺分泌药用蛋白质来制药的转基因动物。羊-乳球蛋白启动子、-抗胰蛋白酶。l（3）供体动物）供体动物英国科学家在1992年12月成功培育出转基因猪，其心脏带有人类的成分；猪心脏来代替人心脏用于移植手术。23 重组DNA技术l转基因植物转基因植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆、作物的高产优质、果蔬储存、作物的固氮能力、药物生产及环境美化等。l（1）抗虫植物）抗虫植物 苏云金杆菌、毒蛋白。23 重组DNA技术l（2）抗除草剂植物）抗除草剂植物草甘磷是一种广谱除草剂。它的靶位点在叶绿

11、体中的EPSP合成酶。由于阻断芳香族氨基酸的合成，植物最终会死亡。l（3）改良药改良药用植物用植物日本科学家用重组DNA技术提高了镇静药莨莞碱合成的效率。l（4）生产疫苗的植物）生产疫苗的植物土豆生产疫苗。23 重组DNA技术l 6.基因诊断和基因治疗基因诊断和基因治疗l 1990年，首例应用基因治疗，治愈一名四岁女孩的腺苷脱氨酶缺乏症。采用逆转录病毒转移腺苷脱氨酶基因。l 基因治疗基因：单基因疾病基因导致腺苷脱氨酶缺乏症、镰刀形贫血病等；肿瘤抑制物基因和肿瘤形成基因等。l 腺病毒、脂质体和单疱疹病毒等囊性纤维化病、帕金森氏病。爱滋病和癌症。23 重组DNA技术全合成基因组全合成基因组23 重

12、组DNA技术l23.6 遗传工程的风险和伦理学问题遗传工程的风险和伦理学问题l1. 对人的影响对人的影响 “超级细菌”、对宗教、习俗和生活方式的影响。 用抗菌素抗性基因整合的转基因食品的利用，遭到一部分人的反对。因为人们担心以后会有太多的抗抗菌素生物产生，甚至产生无法对付的超级病菌。23 重组DNA技术l2. 对环境的影响对环境的影响 转基因的逃逸；超级细菌；超级杂草；对生物多样性的影响。 利用抗除草剂基因筛选的办法，也由于人们担心会产生超级杂草，而遇到类似的情况。l3. 严格的释放规定严格的释放规定 生物安全实验室规则。What is Genetically Modified？什么是转基因？

13、“转基因食品”（Genetically Modified Foods)l是指用转基因生物制造、生产的食品、是指用转基因生物制造、生产的食品、食品原料及食品添加物等。食品原料及食品添加物等。l简称：简称：GMF 第一批列入目录的农业转基因生物第一批列入目录的农业转基因生物l大豆：大豆：大豆种子、大豆、大豆粉、大豆油、豆粕大豆种子、大豆、大豆粉、大豆油、豆粕l玉米：玉米种子、玉米、玉米油、玉米粉玉米：玉米种子、玉米、玉米油、玉米粉l油菜：油菜：油菜种子、油菜籽、油菜籽油、油菜籽粕油菜种子、油菜籽、油菜籽油、油菜籽粕l棉花种子棉花种子l番茄：番茄种子、鲜番茄、番茄酱番茄：番茄种子、鲜番茄、番茄酱小西红柿是转基因食品么？小西红柿是转基因食品么？ 为什么会对为什么会对转基因食品转基因食品有恐惧心理有恐惧心理？转基因食品的安