HPLC法测定油茶籽多肽相对分子质量分布及氨基酸组成

1、收稿日期:20100420作者简介:丁丹华(1984,女,硕士研究生,主要从事油脂及植物蛋白方面的研究工作(E-mailddhwebmailhzaueducn。通讯作者:何东平,教授。要特点是肽回收率很高,同时分辨率高于离子交换色谱和疏水作用色谱。本试验主要采用HPLC 来测定油茶籽多肽的相对分子质量分布及其氨基酸组成。1材料与方法11材料、试剂油茶籽粕由实验室自制,原料经冷榨、低温浸提工艺脱脂处理。三氯乙酸、甲醛、乙腈、三氟乙酸均为色谱纯。相对分子质量参照物:细胞色素C(M r= 12500,杆菌酶(Mr=1450,乙氨酸乙氨酸酪氨酸精氨酸(M r=451,乙氨酸乙氨酸乙氨酸(M r=189

2、购于美国Sigma公司。其他试剂均为国产分析纯试剂。12仪器、设备AB204E型分析天平,LD510型离心机, PHS25数显pH计,Freezone6冷冻干燥机,LM125型超滤试验装置,Waters600高效液相色谱仪(美国Waters公司,配2487紫外检测器、Empower 工作站和GPC软件,中空纤维超滤膜(切割相对分子质量M r=3000。13试验方法131油茶籽多肽的制备制备的工艺流程为:油茶籽粕粉碎碱提离心(3000r/min, 20min上清液酸沉离心(3000r/min, 20min沉淀冷冻干燥油茶籽蛋白粉碎过筛(80目悬浮液(3%热处理(90,20 min调pH酶解(中性

3、蛋白酶灭酶离心(4000r/min,15min上清液树脂脱盐离心上清液冷冻干燥油茶籽多肽超滤透过液冷冻干燥油茶籽多肽132油茶籽多肽水解度(DH的测定pHStat 法7。DH=c(NaOHV(NaOH/(mhtot100%式中:c(NaOH酶解过程中所加碱液的浓度, mol/L;V(NaOH酶解过程中所加碱液的体积,mL;m底物蛋白质的质量,g;氨基的平均解离度,在具体的pH和温度下按=10pHpK/(1+10pHpK(pH为水解溶液的pH,pK可近似取70计算;h tot 底物蛋白质中肽键总数,mmol/g。133平均肽链长度(PCL与平均相对分子质量(Mr的测定8按下式计算:PCL=1/D

4、H,Mr=110PCL+18134油茶籽多肽相对分子质量分布测定1341测定条件采用Waters600高效液相色谱仪,对油茶籽多肽的相对分子质量分布进行测定。色谱柱:TSKgel2000SW XL300mm78mm;流动相:V(乙腈V(水V(三氟乙酸=45550.1;检测波长:UV220nm;流速:05mL/min;柱温:30;进样量:10L。1342样品处理吸取样品溶液2mL于10mL容量瓶中,用流动相稀释至刻度,经微孔过滤膜过滤后测试。135油茶籽多肽氨基酸组成测定采用Waters600高效液相色谱仪(配2487紫外检测器和Breeze工作站。色谱柱:AccQTag氨基酸柱(39mm15c

5、m;流动相A:AccQTag Eluent A;流动相B:V(乙腈V(水=6040;检测波长:UV248nm;流速:0.5mL/min;柱温:30;进样量:10L;保留时间:45min。2结果与分析21油茶籽多肽相对分子质量分布211超滤前油茶籽多肽相对分子质量分布图1是以标准蛋白质的相对分子质量的对数为纵坐标,保留时间为横坐标的lg M r迁移率图,即相对分子质量标准曲线。线性回归方程为:lg M r=6660211t(r=0999240,r2=0998481 。 /%500010917 140171085000 300014017 151671123000 200015167 160672

6、672000 100016067 1761711421000 50017617 191503572500 18019150 21450467318021450 22017128212超滤后油茶籽多肽相对分子质量分布(见图3、表2 /%300014150 151670073000 200015167 160670212000 100016067 176172191000 50017617 191503225500 18019150 21450626518021450 22067264由图3和表2可以看出,经切割相对分子质量3000的超滤膜超滤后,相对分子质量大于5000的大分子肽已经不存在,大于

7、3000的肽所占比例极小,证明超滤膜截留是可靠有效的。相对分子质量小于1000的小分子肽所占比例大幅度提高,上升到9754%。经计算肽链的平均长度为81,平均相对分子质量为9051。研究表明,小分子肽易被人体吸收,而且具有很多生理活性功能,如抗氧化、降血脂、降血压等。因此,对多肽相对分子质量分布的测定为进一步对肽活性部分进行分离和鉴定打下了良好的基础。22油茶籽蛋白和多肽氨基酸组成分析(见表3表3油茶籽蛋白和多肽氨基酸组成及含量g /100g氨基酸油茶籽蛋白油茶籽多肽超滤前超滤后天冬氨酸444358276苏氨酸162258251丝氨酸196098095谷氨酸9671376831脯氨酸17613

8、4108甘氨酸200168124丙氨酸240194098缬氨酸170231078蛋氨酸142121163异亮氨酸184191200亮氨酸328238146酪氨酸134168104苯丙氨酸224156412组氨酸083074181赖氨酸178267329精氨酸510837628由表3可知,经中性蛋白酶酶解制备的油茶籽多肽及超滤后的油茶籽多肽的氨基酸组成同油茶籽蛋白的氨基酸组成相比没有发生改变,但各氨基酸含量改变不尽相同。其中天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸和精氨酸是主要组成氨基酸,超滤前油茶籽多肽的苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和赖氨酸含量与油茶籽蛋白相比略有增加但差异不大;谷氨酸、精氨酸含量则有较大提高。研

9、究发现,除肽相对分子质量大小外,多肽的氨基酸组成及氨基酸排序也是影响多肽生物活性的重要因素。3结论本试验利用高效液相色谱法对油茶籽多肽的相对分子质量分布及氨基酸的组成进行了分析。得出油茶籽多肽的相对分子质量主要集中在3000以下,其中相对分子质量1000以下所占比例最大,达到8373%,肽链的平均长度为8.4,平均相对分子质量为9423。经切割相对分子质量3000的膜超滤后,相对分子质量小于1000的小分子肽所占的比率大幅度提高,上升到9754%。肽链的平均长度为81,平均相对分子质量为9051。与油茶籽蛋白相比,超滤前后油茶籽多肽大部分氨基酸组成和含量无明显差异。7CHINA OILS AN

10、D FATS 2010Vol.35No.11櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂参考文献:1陈钦,郑清芳油茶饼综合利用的研究J福建林学院学报,2000,20(2:971002黎先胜我国油茶资源的开发利用研究J湖南科技学院学报,2005,26(11:1271293龚吉军,李忠海,钟海雁,等茶籽多肽的制备及抗氧化活性研究J食品研究与开发,2007,28(10:59614吴谋成功能食品研究与应用M北京:化学工业出版社,20045纪建国,叶蕴华,邢其毅植物多肽类化合物研究进展J天然产物研究与开发,1998,10(3:80866张伟,孙智达,徐志宏花生多肽的制备及生理功能评价的研究进展J中国油脂,2007,32(1:74767ADLERNISSEN JEnzymic hydrolysis of food proteinsMLondon:Elsevier Applied Science Publishers,19868张宇昊,王强